ＨＩＶ－１前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种用于ＨＩＶ－１前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，其将表达Ｇａｇ／Ｇａｇ－Ｐｏｌ的质粒与表达融合蛋白Ａ的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞ＢＲＥＴ１ｒａｔｉｏ的变化，ＢＲＥＴ１　ｒａｔｉｏ下降，则待检样品为早成熟化诱导剂，所述融合蛋白Ａ为由ｐ２／ｐ７连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白，该荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移１。利用本发明专利技术方法能够方便、快速地筛选早成熟化诱导剂，对ＨＩＶ的治疗药物的筛选提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种筛选HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法。
技术介绍
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染导致人体免疫机能缺陷，而易于发生机会性感染和肿瘤的临床综合征。在过去的20多年里造成2000多万人死亡，目前全世界艾滋病病毒感染者已达4000万左右。艾滋病不仅成为我国严重的卫生健康问题，同时每年造成了上千亿的直接经济损失。据中国卫生部2008年通报，全国累计报告HIV感染者达25万多人，预计则高达约70万人。目前临床使用的传统的抗艾滋病药物虽在抗HIV-1方面起到了很大的作用，但仍存在一些问题，如在人体内活性不高、口服生物利用度低、易产生耐药性或交叉耐药性及生产成本高等。耐药是病毒的药物作用靶位蛋白变异的结果。因为耐药株经常对一组抗病毒药物耐药，并且同一类药物之间交叉耐药非常常见。因此，急需寻找作用于新靶点的高效低毒的抗艾滋病药物。21世纪以来，研究人员的视线已集中到很多的新的靶点上。HIV-1基因组由两条单链正链RNA组成，每个基因组约为9.7kb。结构上包括LTR，结构蛋白编码区(gag)，多种酶活性的蛋白编码区(pol)，外膜蛋白(env)编码区以及6个调节基因。gag基因编码病毒的核心蛋白，翻译时先形成一个分子量大约是55kD的前体蛋白(p55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成matrix(MA)、capsid(CA)、p2、nucleocapsid(NC)、p1和p6gag。pol基因产物与各种酶的功能相关，如HIV-1蛋白酶(PR)，逆转录酶(RT)、整合酶(IN)等。Pol基因不能单独翻译，gag基因翻译过程中，会有5％～10％的几率发生特定的移码，使翻译继续下去，得到160kD的Gag-Pol。Gag-Pol在HIV蛋白酶的作用下裂解成MA、CA、p2、NC、移码蛋白(TF)、PR、RT、IN。HIV-1蛋白酶(protease，PR)是由HIV-1pol基因5’端所编码。该酶含99个氨基酸，属天冬氨酸蛋白酶。全酶为旋光对称的同源二聚体，而二者界面形成酶活性中心。HIV-1PR作为前体蛋白(precursor)Gag-Pol的一部分被翻译出来，前体蛋白形式的PR处于无活性状态。Gag-Pol通过与HIV-1另一前体蛋白Gag相互结合，形成未成熟的病毒颗粒。病毒颗粒装配完成后，在病毒出芽或者出芽后的瞬间，Gag-Pol中的PR被激活，将Gag-Pol和Gag剪切成为较小的成熟结构蛋白和酶(包括逆转录酶和整合酶)，这个过程称为病毒的成熟化。只有经过PR酶切加工形成的成熟病毒颗粒才具有感染性。目前，针对HIV-1PR的药物研究集中在抑制其活性上，使前体蛋白Gag和Gag-Pol不能被酶切成为结构蛋白和酶，不能形成成熟的病毒颗粒，从而可达到抗病毒的效果。HIV蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor，PI)自1995年应用于临床以来已取得了显著成果，但易产生耐药及交叉耐药，且不能彻底治愈艾滋病。HIV-1PR活性的严格调控对于病毒的生存至关重要。研究表明，如果Gag-Pol中的-->PR在装配完成前被激活，会导致前体蛋白Gag-Pol和Gag被提前酶切加工，这一过程被统称为前体蛋白早成熟化(premature)。一旦发生前体蛋白早成熟化，病毒颗粒便无法装配，因此病毒颗粒的产量将显著减少，甚至无病毒颗粒产生。目前，HIV-1病毒装配完成前，细胞内Gag-Pol中PR活性的抑制机制，以及装配完成后，PR被迅速激活的机制尚不清除。尽管如此，如果能干扰HIV-1PR活性的调控机制，特异性的激活前体蛋白中的PR，诱导前体蛋白早成熟化，就可以直接抑制病毒的复制。然而，到目前还没有一种能够用于筛选这种诱导剂的方法。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术提供一种HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法。本专利技术提供的HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，包括步骤：将表达Gag/Gag-Pol的质粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞BRET1 ratio的变化，BRET1 ratio下降，则待检样品为早成熟化诱导剂。所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白。上述荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移1(Bioluminescence resonance energy transfer1，BRET1)。上述荧光酶可选自：海肾荧光素酶。相应的荧光酶激发受体可选自：EYFP、EGFP、YFP、GFP。在专利技术实例中，一种优选的融合蛋白为EYFP-p2/p7-Rluc。所述表达Gag/Gag-Pol的质粒为pVRC4200质粒。所述表达融合蛋白A的质粒为pEYFP-p2/p7-Rluc。所述宿主细胞为293T细胞。具体地首先构建表达融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc的质粒pEYFP-p2/p7-Rluc，将其与表达Gag/Gag-Pol的质粒pVRC4200质粒共转染293T细胞，转染24h后，添加样品至转染后的293T细胞，再培养16h，检测细胞BRET1 ratio的变化。如样品对该模型有效，即能够提前激活Gag-Pol中的PR，则BRET1 ratio下降。本专利技术运用生物发光共振能量转移1(Bioluminescence resonanceenergy transfer1，BRET1)技术，建立了细胞水平的HIV-1前体蛋白早成熟化激活剂筛选模型。这一模型的原理为在增强的黄色荧光蛋白(EYFP)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase，Rluc)之间插入HIV-1 PR的识别序列p2/p7(ATIMMQRG)，表达为融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc，加入Rluc底物coelenterazine h(λem～475nm)，在Rluc与EYFP距离小于时，催化产生的光波能量转移，激发受体EYFP(λem～535nm)。生物发光共振能量转移比例(BRET1 ratio)＝535nm发射光强度/475nm发射光强度(表达融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc)-535nm发射光强度/475nm发射光强度(只表达蛋白Rluc)。同HIV-1基因组相似，pVRC4200表达Gag和Gag-Pol，两者比例20∶1，可形成病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)。将pEYFP-p2/p7-Rluc质粒与pVRC4200质粒共转染293T细胞，如加入的化合物能够提前激活Gag-Pol中的PR，细胞内的HIV-1PR活性升高，HIV-1PR识别EYFP和Rluc之间的p2/p7序列，酶切融合蛋白EYFP-p2/p7-Rluc，使得EYFP和Rluc分开，距离大于将无生物发光共振能量转移现象，BRET1 ratio将下降。-->本专利技术方法提供了一种用于HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂筛选的方法，利用该方法能够方便、快速地筛选早成熟化诱导剂，对HIV的治本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＨＩＶ－１前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，其特征在于将表达Ｇａｇ／Ｇａｇ－Ｐｏｌ的质粒与表达融合蛋白Ａ的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞ＢＲＥＴ１　ｒａｔｉｏ的变化，ＢＲＥＴ１　ｒａｔｉｏ下降，则待检样品为早成熟化诱导剂，所述融合蛋白Ａ为由ｐ２／ｐ７连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白，该荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移１。

【技术特征摘要】
1.HIV-1前体蛋白早成熟化诱导剂的筛选方法，其特征在于将表达Gag/Gag-Pol的质粒与表达融合蛋白A的质粒共转染宿主细胞，添加待检样品至共转染后的宿主细胞，检测细胞BRET1 ratio的变化，BRET1 ratio下降，则待检样品为早成熟化诱导剂，所述融合蛋白A为由p2/p7连接的，一端为荧光素酶，另一端为荧光素酶激发受体的融合蛋白，该荧光素酶与荧光素酶激发受体之间能够产生生物发光共振能量转移1。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光酶选自：海肾荧光素酶。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述荧光酶激发受体选自：EYFP、EGFP、YFP、GFP。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白为...

【专利技术属性】
技术研发人员：岑山，张全，李晓宇，魏晓露，刘振龙，贾平平，杨亮，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]