本发明专利技术属于生物化学和医药技术领域，涉及一种能特异性靶向人肺组织肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体、其制备方法及其应用。所述纳米抗体包括如Q(X)2LVESGG(X)2V(X)2G(X)SL(X)LS(X)24E(X)n2KG(X)4S(X)n3T(X)2Y(X)C(X)n4S(X)n5V(X)n6R所示的氨基酸序列；其中，X表示任意氨基酸，n2～n6为正整数，1≤n2≤21，1≤n3≤19，1≤n4≤50，1≤n5≤22，1≤n6≤8。本发明专利技术中用人肺新鲜冰冻切片为抗原，亲和淘筛前期构建好的SP-A纳米抗体库，并获得能与人肺SP-A具有高结合力的基因序列，再通过原核表达载体对这些基因序列进行蛋白诱导表达，即得到分子量小，亲和力强的纳米抗体。随后使用细胞荧光、免疫组化和裸鼠体内显像的方法检测出所获得的人肺组织纳米抗体存在高度特异性肺靶向性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学和医药
，涉及一种能特异性靶向人肺组织肺泡表面 活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体。
技术介绍
20世纪初，诺贝尔奖获得者德国科学家Paul Ehrlich针对未来药物发展提出了 "魔法子弹"这一想法，即理想的治疗药物能只选择性地破坏患病细胞而不影响健康细胞。 在过去的几十年里，科学家们一直致力于探索这种理想药物的开发。 20世纪70年代，靶向给药系统诞生，并在肿瘤治疗应用领域得到了迅速发展，随 着研宄的逐步深入，新型靶向给药载体的不断出现及给药途径的拓宽，靶向药物的研宄扩 展至肿瘤以外的其他系统疾病的治疗中。 呼吸系统疾病的靶向药物开发也是研宄热点之一，目前主要集中在以下方面： 1、通过吸入给药实现部分气道疾病的靶向治疗。 例如，从20世纪50年代始，吸入激素逐渐用于哮喘和coro的治疗。此后，随着吸 入药物和装置的不断改进，目前吸入激素已成为哮喘和coro治疗的主要措施。但吸入药物 主要适用于气道疾病的局部治疗，而对于气道之外的肺实质和肺间质性疾病，吸入激素因 生物利用度过低而疗效较差。 2、通过药物载体实现药物的被动肺靶向。目前已有多种药物载体如脂质体、微粒、微球等用于肺靶向药物的研宄。然而，这 种被动靶向对组织器官的选择性差，无法避免肝脾等其他器官的大量截留，因此，仍未获得 理想的靶向效果。由于配体-受体或抗原-抗体结合是人体内的一种特殊识别机制，据文献报道，利 用该识别机制可实现药物的主动靶向，增强药物疗效，减少副作用。比如用紫杉醇脂质体 与针对表皮生长因子的单克隆抗体制成的复合物，抗肿瘤效果较无单抗组增强25倍。因 此，要实现理想的肺主动靶向，寻找具有高度特异性的肺组织靶向分子和制备高亲和力的 靶向配体是最关键的因素。现有研宄表明，在肺组织中，II型肺泡上皮细胞是肺组织所特有 的具有增殖和分泌功能的细胞，约占肺实质细胞总数的16%。II型细胞能合成和分泌肺泡 表面活性物质。肺泡表面活性物质的主要成份为脂质（90%)和蛋白（10%)，其中蛋白成 份为特异性肺泡表面活性蛋白（surfactant protein，SP)。目前按SP被发现的先后命名 为SP-A、SP-B、SP-C、SP-D，其中SP-A是最早发现且在II型肺泡上皮细胞中强烈表达、信号 最为丰富的蛋白，而在肺外表达量极少，表现为高度肺特异性，是一种理想的特异性肺组织 革巴向分子。 理想的靶向配体除具有高亲和力外，还应具备分子量小、穿透力强、免疫原性弱的 特点。抗原-抗体结合是最强的识别机制，因此，抗体是配体制备的首选。然而，完整的抗 体分子虽亲和力高，但分子量大（相对分子量为150000)，组织穿透能力弱，免疫原性强，并 不是理想的配体。随着抗体工程、基因工程等技术的发展，对抗体进行工程化改造而成的抗 体片段（Fab、ScFv)现已具备了分子量小、免疫原性弱的优势，但相对完整抗体分子，其稳 定性、亲和力均降低。 1993年比利时科学家首次报道在骆驼类动物血中存在没有轻链的重链抗体 (HCAbs)。该重链抗体的重链可变区（variable domain of heavy chains of HCAbs，VHH) 具有完整、独立的抗原结合能力，若克隆该可变区，即可得到一个大小尺寸在纳米级别的单 域抗体，又称纳米抗体（nanobodies?，Nbs)。纳米抗体作为配体具有许多优势：1)分子 量小，组织穿透力强，亲和力高。它是目前已知分子量最小的抗体分子，其相对分子量仅为 15000;穿透能力明显优于完整抗体分子，与特异抗原的亲和力达nmol级。2)结构稳定，即 使在37°C放置一周或在高温条件（90°C)下保存，或在离液剂、蛋白酶和极性PH值等强变 性条件下，均能保持高度稳定性。3)免疫原性小，其基因与人源VH基因 III家族序列具有较 高的同源性，对人体的免疫原性弱，生物相容性好。由于纳米抗体的这些优势，现作为一种 新型的抗体药物正在广泛研宄。但其作为SP-A靶向配体及是否可实现人肺组织靶向性的 研宄在国内外尚未见报导。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的。本专利技术的专利技术人在先申请的专利技术专 利CN104109207A公开了一种针对大鼠肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体，专利技术人在该 专利申请的基础上继续研宄了在人肺组织的表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体。 本专利技术提供了一种靶向人肺组织的纳米抗体、其制备方法及其应用。 本专利技术还提供了一种编码靶向人肺组织的纳米抗体的核酸分子。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案： 本专利技术的第一个方面是提供一种靶向人肺组织的纳米抗体，所述纳米抗体包括如 Q (X) 2LVESGG ⑴ 2V ⑴ 2G ⑴ SL ⑴ LS ⑴ 24E (X) JG ⑴ 4S ⑴ n3T ⑴ 2Y (X) C ⑴ n4S ⑴ n5V ⑴ n6R 所 示的氨基酸序列；其中，X表示任意氨基酸，n2~n6为正整数，1 <η2<21，1 19， 1彡n4彡50,1彡n5彡22,1彡n6彡8 ;优选地，17彡n2彡21，n3为18或19,16彡n4彡50， 17彡n5彡22, n6为7或8。 在本专利技术所述纳米抗体的一个优选实施例中，所述纳米抗体包括如Q(X1) LVESGG (X2) V (X3) G (X4) SL (X5) LS (X6) E (X7) KG (X8) S (X9) T (Xltl) Y (X11) C (X12) S (X13) V (X14) R 所示 的氨基酸序列；其中， X^LQ 或 VK; 或 DL; X3是 QS 或 QP ; X4是 G; X^I、S、R或T; 乂6是 CTASGSDYRWMYIARFRQCPGKER、 CAASEFTLDYYEIGWFRQAPGKDR, CAASGFNLDDYADIGWFRQAPGKER、 CAVRGRDLDYYVIGWFRQAPGKER, CTASKFHLDSYAVAWFRQTPGKER、 CAASGFTFNDYRMSWVRQAPGKGL 或 CTASGTFIQYSMGWYRRPQR ; X7 是 GVAAIYTDDTDDSSPIYATSA、GLSCIGYSDRIAYYSESV、 RVLCITISDGTTYYEDSG,GVSCINNSDDTTYYSDSV, AVSFINTSDDVTYFADSV、WVSDINSGGSSTYYADSV 或 LVAEMLNGGDTQYSDSV ； 父8是 RFTIRFSIRFTV ; X9 是 QDKDKNAVYLQMNSPKPED、RDDATSTVSLYMDMMIPED、 TDIAKNTVFLQMDSLKAED, RDHAKNTVYLQMNNLKPED, RDNSKNTVYLQMNVLKPED、RDNAKNTLYLQMNSLKPED 或 RTNNTMYLHMNNLKPED ； Xltl是 AMGTALSIAIAV ; 心表示一个任意氨基酸残基或者空白； 父12是 AARAFGGTffSLSSPDDFSAWGQGTQVTVS, AGSVVEPYELLPAAEYDYWGQGTRVTVS, AGDPAPFCLYNTYVPRTWGQGTQVTVS, AADF本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向人肺组织的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如Q(X)2LVESGG(X)2V(X)2G(X)SL(X)LS(X)24E(X)n2KG(X)4S(X)n3T(X)2Y(X)C(X)n4S(X)n5V(X)n6R所示的氨基酸序列；其中，X表示任意氨基酸，n2～n6为正整数，1≤n2≤21，1≤n3≤19，1≤n4≤50，1≤n5≤22，1≤n6≤8。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李惠萍，何鲜，王珊梅，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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