中华鳖微卫星ＤＮＡ标记制造技术

本发明专利技术公开了中华鳖微卫星ＤＮＡ标记，包括中华鳖微卫星（ＣＡ）ｎ、（ＡＡＣ）ｎ、（ＡＣＡＧ）ｎ和（ＧＡＴＡ）ｎ富集文库的构建，微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到６３个含有微卫星重复序列的克隆，确定了１５个多态性丰富的微卫星标记ＰＳＷ０１、ＰＳＷ０２、ＰＳＷ０３、ＰＳＷ０４、ＰＳＷ０５、ＰＳＷ０６、ＰＳＷ０７、ＰＳＷ０８、ＰＳＷ０９、ＰＳＷ１０、ＰＳＷ１１、ＰＳＷ１２、ＰＳＷ１３、ＰＳＷ１４、ＰＳＷ１５；本发明专利技术可应用于中华鳖不同地理种群的遗传多样性研究以及亲权鉴定的研究，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分子标记技术，具体涉及一种中华鳖微卫星DNA遗传标记。
技术介绍
微卫星DNA又称为短串连重复序列(STR)、简单重复序列(SSR)、简单序列长度多 态性(SSLP)，是指基因组中以1-6个核苷酸为单位串联重复组成的核苷酸序列；其中，最常 见的是双核苷酸重复，如((AC/TG)n及(AG/TC)n。不同的生物个体由于重复基序的重复次 数不同而显示出多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)现 象造成微卫星DNA多态性信息容量(polymorphic information content, PIC)较高。微卫 星DNA的高突变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，使其成为群体遗传多 样性的分析、亲缘关系的鉴定、基因组作图和遗传育种的优越的分子标记，与等位酶、RAPD 方法相比也有一定的优越性。由于微卫星具有数量多、在基因组内分布均勻、多态性信息丰 富、易于检测等优点被作为优良的遗传标记(genetic marker)而得到广泛应用。根据重复 单元的构成与分布，微卫星DNA序列被分为三种类型单一型(pure)，复合型(compound)， 间断型(interrupted)，例如单一型CACACACACACACACACACA复合型CACACACACACAGAGAGAGA间断型CACATTCACACATTCATTCA中华鳖，又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老鳖，英文名ChineseSoftshell Turtle，拉丁文名(Pelodiscus sinensis)，中国除宁夏、新疆、青海及西藏未见报道外， 其余各省、市、自治区均有分布，以长江流域和华南地区为多见；国外分布于日本、朝鲜和越 南。中华鳖由于其药用价值和营养价值，长期被大量消耗。而且，近年来的过度捕捞、生境破 坏、化学污染等，已经导致中华鳖野生种群数量急剧下降。因此，中华鳖已被作为易危物种 列入了 1998年《中国濒危动物红皮书》和2000年IUCN(世界自然保护联盟)濒危物种红色 名录中。可见对野生种群的保护已经迫在眉睫了，但要制定切实有效的保护计划，就必须要 了解野生种群结构和遗传多样性等方面的信息。已经有学者采用不同的分子标记技术(包 括线粒体细胞色素b基因序列、12S rRNA、RAPD等)对中华鳖的遗传多样性进行研究，但是 上述遗传标记不能提供足够的遗传信息，如张永正等，中华鳖(Pelodiscus sinensis) 5个 不同地理种群细胞色素b基因序列变异及种群遗传结构分析；吴平等，亚洲淡水和陆生龟 鳖类12S rRNA基因片段的序列分析和系统发生研究；肖亚梅等，中华鳖种群RAPD分析。为 了进一步了解中华鳖野生种群结构和遗传多样性等方面的信息，需要开发新的分子遗传标 记。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于分离克隆中华鳖微卫星DNA标记，建立中华鳖 微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行中华鳖的分类，亲权鉴定及遗传多样性的分析。本专利技术解决技术问题的技术方案中华鳖微卫星DNA标记，包括中华鳖微卫星 (CA)n, (AAC)n, (ACAG)1^P (GATA)n富集文库的构建，含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测 序，得到63个含有微卫星重复序列的克隆，确定了 22个多态性丰富的微卫星标记PSW01、 PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSfflU PSW12、PSW13、 PSW14.PSW15 ；PSffOl为472个核苷酸、PSW02为375个核苷酸、PSW03为368个核苷酸、PSW04 为416个核苷酸、PSW05为346个核苷酸、PSW06为423个核苷酸、PSW07为337个核苷酸、 PSW08为379个核苷酸、PSW09为291个核苷酸、PSWlO为336个核苷酸、PSWll为345个核 苷酸、PSW12为367个核苷酸、PSW13为356个核苷酸、PSW14为371个核苷酸、PSW15为396 个核苷酸。附图说明图1 :PSW01位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型2 :PSW02位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型3 :PSW03位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型4 :PSW04位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型5 :PSW05位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型6 :PSW06位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型7 :PSW07位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型8 :PSW08位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型9 :PSW09位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型10 =PSfflO位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型11 =PSffll位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型12 :PSW12位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型13 :PSW13位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型14 :PSW14位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型15 :PSW15位点的引物扩增22只中华鳖基因组DNA的STR分型图在图1-图15中，1-22分别代表1-22只中华鳖。具体实施例方式下面结合附图进一步详述本专利技术。1、中华鳖微卫星DNA富集文库的构建1. 1 基因组的提取与酶切参照 Sambrook 等(2002，Molecular Cloning, 3nd463-471)的方法提取中华鳖基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AI (购自TaKaRa公司) 酶切基因组，酶切产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下400-1000bp大小的DNA片段 并用胶回收试剂盒(购自上海生工)纯化回收的酶切产物。1. 2 加接头将纯化回收的酶切产物的两端加入接头SauL-F (5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，) SauL-R(5，-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC_3，)，在T4连接酶(购自Promega公司)作用下16°C水浴连接过夜。1.3PCR检测接头连接以SauL-F为引物，以1. 2工序制的连接产物为模板进行PCR，50 μ L反应体系如 下5yL IOXexTaq 缓冲液，4 μ L MgCl2,4y L dNTP,0. 25 μ L exTaq 酶(购自 TaKaRa 公 司)，2yL引物SauL-F，5yL连接产物，加双蒸水(ddH20)补至50 μ L。PCR反应程序如下 95°C预变性5分钟，94°C变性45秒，60°C退火45秒，72°C延伸1分钟，变性至退火三个步 骤重复35次，72°C充分延伸10分钟。PCR产物用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯 化。1. 4磁珠富集将1. 3所制的纯化产物与生物素标记的寡核苷酸探针杂交探针(CA) 12、(AAC)8, (ACAG) 6和(GATA) 6分别在72°C、58°C、67°C、55°C下杂交7小时。将杂交液加入已平衡好的 磁珠，室温放置30分钟。将离本文档来自技高网...

【技术保护点】
中华鳖微卫星ＤＮＡ标记，其特征在于：所述的微卫星标记编号分别为：ＰＳＷ０１、ＰＳＷ０２、ＰＳＷ０３、ＰＳＷ０４、ＰＳＷ０５、ＰＳＷ０６、ＰＳＷ０７、ＰＳＷ０８、ＰＳＷ０９、ＰＳＷ１０、ＰＳＷ１１、ＰＳＷ１２、ＰＳＷ１３、ＰＳＷ１４、ＰＳＷ１５；其核苷酸序列为：ＰＳＷ０１：ｃｔｃｔｃｔｃａｃｃ　ｃａｃａｔａｔｔｃｃ　ｃｃｃａｔｃｃａｔｃ　ｃａａｇａａａｃａｔ　ｇｃｔｇｔｔｇｔｔｔ　ｔｇｔａｔｇａｔｇａ　６０ｇａａｔａｇａａｃａ　ｇａｔｔａａａａｇｇ　ａｇａｇｇａｔｔａａ　ｃｔｔｔｃａａｇｇａ　ｇｇｇｔｔｔａｇｃｔ　ａｇｃｔａｔａｃｔｔ　１２０ａｃｇｇｇｔｇａｔａ　ｃｔｔｔｇａａａｔｃ　ａｔｃａｃａａａｃａ　ｔｔｔａｃｇｔｃａａ　ｔｃａｃａｔｇｔｔｃ　ｃａｔｔｔａａｃｇａ　１８０ｔａｇａｔａｇａｔａ　ｇａｔａｇａｔａｇａ　ｔａｇａｔａｇａｔａ　ｇａｔａｇａｔａｇａ　ｔａｇａｔａｇｇｔａ　ｇａｔａｇａｔａｇａ　２４０ｔａｇａｔａｇａｔａ　ｇａｔａｇａｔａｇａ　ｔａｇａｔａｇｇｔａ　ｇａｔａｇｃｃａｃｔ　ａｔｔａｃａｇｃａａ　ａｔｔｔａａａａｔｇ　３００８０ｔｔｃａｃｔｃｔｇｔ　ｇａｇｇｔａａｃｔａ　ａｔｔｃｃｔｇｃｔａ　ｔｇｇａａｇａａｃｃ　ｔｔｃｃｃｔｃｃｃａ　ａｔａｃｃｃａａａｔ　２４０ｃｔｇａｇａｃｔｇｃ　ｔａｃｃａｃａｔｃｃ　ｃａｔｃａｇｇｇｔａ　ａｃｔｃｃａｇｔｇｇ　ｇａｃａｃａｃｃａｇ　ｃｔｃｔｔｃｔｇｔｔ　３００ｔｔｃａｇｃｇａｃｔ　ｇｔｇａｇｇａｔｔｔ　ｃｔｃｔｃａｇｃｔａ　ｔｇｔｇｃａ　３３６ＰＳＷ１１：ｔａｃａａａａａａｔ　ｃａｔｔｃａａｔａｇ　ｔａａｔｔａｔｇｇｇ　ａｔａａｔｃｔｇｃｔ　ｃｃａｇａｇａａａｇ　ｔｔｔｃｔｔｃｔｔａ　６０ａｔｃｃｔｔａａｔａ　ｇｇｔａｇａｇｇｔｔ　ｇｔｃｔｔａｔｔｃｔ　ｃｔｇｃａｇｃａｇｇ　ａｇａｇｔｔｔａｔａ　ｔｃｔｃｔｔｔｃａａ　１２０ａａｃｔｃａｔｔｔｔ　ｔｇｇｔａｔｔｇｔｔ　ｔｇｔｔｔｇｔａｇｇ　ｇａｔｔｔａｔｔｔｔ　ａａａｔｃｃｔｃａｃ　ｔｇｔｔａｔａｔｇｔ　１８０ｃｃａｇａｇｔｇｔａ　ｇａｔａｇａｔａｇａ　ｔａｇａｔａｇａｔａ　ｇａｔａｇａｔａｇａ　ｔａｇａｔａｇａｔａ　ｇａｔａｇａｔａｇａ　２４０ｔａｇａｔａｇａｔａ　ｇａｔａｇｃｔｇｔａｔａａａａ　ｇａｃａｇｇｔａｔｔ　ａｔａｔａａａａｇａ　ｃａｇｇｔａｔｔａｔ　ｃｃｃａｇａｔｔｔａ　ｔａｇａｃａｃａ...

【技术特征摘要】
中华鳖微卫星DNA标记，其特征在于所述的微卫星标记编号分别为PSW01、PSW02、PSW03、PSW04、PSW05、PSW06、PSW07、PSW08、PSW09、PSW10、PSW11、PSW12、PSW13、PSW14、PSW15；其核苷酸序列为PSW01ctctctcacc cacatattcc cccatccatc caagaaacat gctgttgttt tgtatgatga60gaatagaaca gattaaaagg agaggattaa ctttcaagga gggtttagct agctatactt120acgggtgata ctttgaaatc atcacaaaca tttacgtcaa tcacatgttc catttaacga180tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagataggta gatagataga240tagatagata gatagataga tagataggta gatagccact attacagcaa atttaaaatg300ctgtataaaa gacaggtatt atataaaaga caggtattat cccagattta tagacacatg360atttgcagga aacaagtata ggatgttaaa atcccaattc agcaaaacac ttaagcacat420gcttaaatca cactgaagtg atcaggattt aagtgctttg ctgaactgtt ta472PSW02tgccaatata gtctcagtag tatagacttg ccctaaaaga ttaaaatggc agatatgagg60tcttctccta gaagcactgt gtgcaaaatt gtacactttc atatgcgcta tgtttgtcaa120tgtcaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaacaac aacaacaaca aaaacctgct180gtttttccct aagtgagatg ttctaacaac ttccttctag gacaaggtgg aaagtagcaa240ttgctacctc cactagtatt agctgttttt ggtccaattc attacacttt gttcccaaac300accaagaaaa gtgtattgct ctgatagcac ttactgtaga agagttttca gaagagagaa360tccaatgtcc tcaca 375PSW03gctataatgt ttgctaagtt ttcctatttt tccatgtatt ttgcagttag taagtgtttt60aatgaaaatt acaattgctt tgaactggcc attctccttg gggccgtacc ggacgtttca120cttgtatgca ttaatattga catataattg ctagacatag aattgcaaga tatctacaca180tctttcgata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagatttg240tgcatctgtc tgtctgtccc tgagtccatc tattccatct gtctgtctgg gagtccattt300gtttaagaac tcctcctaaa ctgtaagaac aaggaccata caactcgaaa tttctcttgt360cctaactt 368PSW04tgagccaatt tccagatcgc cttgactgat tttcaaatca cctgaccatc tgtttcaaat60ttaagcatcc caaagtgcac aaagtctaaa tagataaggc aagtcttaaa ttatgtacag120agtgatactt taaatgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag180atagatagat agatagatag atagaattcc atccgcaggg ctatcgttaa ctttaaggca240tataactgta tttgtatctg agagaaaaaa tcattgttga gataatatat ctgaagataa300ctcacaaatg aatgcacaaa gtaagatggc agagagaaag tccaagggga ctcactaata360atacttcaca cagaattgtt aagattgtca ttctgagata ttccagctag aattat416PSW05aatgatgcaa agagacaaat taagtgtttg atgcatattt tattcccctt gaacgcactc60tgtctaaaaa taatagtgct attatttttg gacagccact ggcttagtgg ccaactgttt120gattgctaga atgcaagttc ttaagtatag atagatagat agatagatag atagatagat180agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag agttatgtga240ttaaatgcca ttaccattat gcattccctg tttttgtgta atgcctgcat aagattttta300gatggcataa agggaaacac tatgagcaaa atgttcctgt ttgatc 346 PSW06ggttggccac tttaagtgaa gcaggttcag ctcgctgatg ttagaggcaa atgtcccccc60atttggccct gaggagagtc aggatgacac tgaattagag gtagtggaag acagaagata120tagaagggta gctccagaaa agaagtgggg aaaggaggat gtggggaaat gctgaagaaa180gcttcaggca gggaatgaac atccgtagtg gttaccccgg gatgggggta aaaacaacaa240caacaacaac aacaacaaca acaaaacaac ctaggaagct gcttgaaacc ctttggaatg300aagttaaatc ctgggagaag agatatggca tgtgaaagac tctcgttttc ctggaatgga360agatatcctt attggctaac taatatatga aataccacta aggccttgca cccacctgct420ccc 423PSW07cttctccccc gaatcttttc caagccccac acatatcttc tttattactg tcaagtgctg60tccccctctt ttgattccca acaatagatt tggactatcc aagcttccga caagaaggtg120agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagatagat180agatagatag atagatagat agatagatag aggaattact tggggatact tctgtctgct240cacaggacca tggacaaaca ggattatgga ttcgcttcaa cacagagtct aatagggata300atttgtttta ttagtctcac tgcgtcactg ctactac 337PSW08acttttggag aacaatcaaa ccccaaaata ttttgcttta gaaatgtcac cacactacct60atttccccaa gaaggaagac tattgtgcat catggtgcat gcactatgta cagcctgcag120gagagaccag accatgaggc atcatagctg tatttccaaa tcaatagata gatagataga180tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga240tagatagata gatagataga tagatatctt gcttaaaagt tccaagtatt agaggagtgg300actaagaaca ctttccaaga aatgcctcca ctaacacaat aacactgtgc ttcctctcaa360atttcagttt gtcagagaa 379PSW09ctagaaatct agctctgcta tg...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂刘旺，卜兴江，刘罗，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]