本发明专利技术公开了一种测定中华鳖体内姜黄素类化合物含量的方法，步骤是：A、中华鳖血浆、肌肉和皮肤采用溶液A提取；B、将提取液挥干；C、用溶液溶解氮吹后的残渣，加入试剂；D、吸取下层液体过聚醚砜水系滤头，过滤液放置到瓶中，测定；E、超高效液相色谱分析：流动相的有机相为试剂，水相为溶液，溶液与试剂两者的体积比，流速，柱温，获得峰面积；F、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素标准溶液的质量浓度和峰面积分别为横坐标，纵坐标，绘制标准曲线；G、测定中华鳖血浆、肌肉和皮肤中的含量。操作方便快捷，分析时间短，准确性和灵敏度高。适于快速准确测定中华鳖体内组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产品检测
，更具体涉及一种测定中华鳖体内姜黄素类化合物含量的超高效液相色谱(UPLC)法，它适用于中华鳖体内血浆、肌肉和皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量。
技术介绍
姜黄素类化合物主要包括双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素，2014年我国农业部批准姜黄素作为新饲料添加剂使用。姜黄素能够促水产动物生长，增强水产动物免疫功能、改善肌肉品质和色泽等。在龟鳖的饲料中添加姜黄素可以改善龟鳖的体色，从而提高其商品价值。姜黄素不仅可促进大黄鱼的生长，还可促进大黄鱼皮肤和肌肉的着色。饲料中添加姜黄素可以显著提高水产动物的抗氧化能力。姜黄素添加到饲料中还能够预防水产动物的小瓜虫病、肠炎病和赤皮病等疾病。因此，姜黄素被广泛应用在中华鳖等水产养殖动物中。由于目前国内外尚未见中华鳖等水产动物体内组织中姜黄素类化合物含量测定方法的报道，因此无法开展姜黄素在中华鳖体内代谢、生物利用度及其着色机理等药理学研究。为姜黄素在中华鳖进行高效开发利用，就需要定量研究姜黄素在中华鳖体内的含量，就需要有一种对中华鳖体内姜黄素有准确定量的分析方法，因此，非常有必要开发一种对中华鳖体内组织中姜黄素类化合物含量进行测定的分析方法。
技术实现思路
本专利技术目的是在于提供了一种测定中华鳖体内姜黄素类化合物含量的方法。该方法操作方便快捷，分析时间短，准确性和灵敏度高。适于快速准确测定中华鳖体内组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施：一种测定中华鳖体内姜黄素类化合物含量的方法，其步骤是：A、中华鳖血浆、肌肉或皮肤组织中姜黄素类化合物采用4～5mL溶液A提取，涡旋28－32s，再加入0.5～1.0g试剂B，涡旋28－32s，7000r/min，离心4－6min，上层液体转移到至10mL离心管中，残渣重复提取一次，合并二次的提取液。B、将提取液置48－52℃氮吹仪(大森DS-K200型)上，将步骤A中的提取液挥干；C、再用1mL溶液C溶解氮吹后的残渣，加入0～0.5mL试剂D，涡旋28－32s，8000r/min，离心4－6min，用移液器将上层液体弃去；D、用1mL注射器吸取下层液体过0.22μm聚醚砜水系滤头，过滤液(溶解有双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的溶液C，1mL)放置到2mL进样瓶(Waters，12×32mm，带盖)中，超高效液相色谱(UPLC)测定。获得中华鳖血浆、肌肉或皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的色谱图，通过对色谱图积分得到双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的峰面积。E、超高效液相色谱(UPLC)分析条件：流动相的有机相为试剂E，水相为溶液F，有机相与水相比为1:1～4:3；流速为0.3mL/min，柱温为28－32℃，检测波长为428nm，色谱柱：超高效液相色谱柱ACQUITYUPLCBEHC18(100mm×2.1mm，1.7μm)，进样量为5.0μL。采用双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素标准曲线方程计算中华鳖血浆、肌肉和皮肤中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量。获得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的色谱图，通过色谱图积分得出双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的峰面积，再将峰面积分别代入双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的标准曲线方程，计算出中华鳖血浆、肌肉和皮肤中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量。F、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素标准溶液的质量浓度分别为横坐标x1，x2，x3，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的峰面积分别为纵坐标y1，y2，y3，绘制双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的标准曲线，获得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的准曲线方程。G、将测定中华鳖血浆、肌肉和皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的峰面积值代入标准曲线方程中，计算得到中华鳖血浆、肌肉和皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的含量；优选的，所述的溶液A中是乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇、乙腈(含0.1％(体积比)乙酸)、甲醇(含0.1％(体积比)乙酸)、乙醇(含0.1％(体积比)乙酸)、乙酸乙酯(含0.01％(体积比)乙酸)、乙腈(含0.01％(体积比)乙酸)、甲醇(含0.01％(体积比)乙酸)、乙醇(含0.01％(体积比)乙酸)中任一种液体试剂；优选的，所述的试剂B是无水硫酸钠、无水硫酸镁、固相萃取C18填料、固相萃取PSA填料中的任一种试剂；优选的，所述的溶液C是试剂E和溶液F按体积比1:1～4:3混合而成的溶液；优选的，所述的试剂D是正己烷、乙醚、乙酸乙酯、正庚烷、环己烷中的任一种试剂；优选的，所述的试剂E是乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇中的任一种试剂；优选的，所述的溶液F是0.1％(体积比)甲酸水溶液、0.1％(体积比)乙酸水溶液、0.01％(体积比)甲酸水溶液、0.01％(体积比)乙酸水溶液中的任一种试剂；优选的，所述的溶液C是试剂E与溶液F按体积比1:1～4:3混合而成的溶液；所述的溶液C的配制方法：试剂E和溶液F按体积比1:1的比例混合而成。所述的溶液F的配制方法：取100μL或1000μL的甲酸或乙酸加入到1L蒸馏水混匀，配制成溶液F，其浓度为0.01％或0.1％(体积比)。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：(1)该测定方法前处理过程简单、操作方便(该测定方法1个样品的前处理时间小于1.5h)。(2)该方法测定时间短，完成一个样品的测定工作仅为5min，测定时间仅为高效液相色谱测定时间的1/5，测定准确率高见表1；(3)该方法测定时所用试剂消耗量少，测定一个样品需要消耗试剂1.5mL，仅为高效液相色谱测定消耗量的1/4。表1.中华鳖血浆、肌肉、皮肤等空白组织中添加双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素测定含量及精密度结果附图说明图1为一种测定3种姜黄素类化合物标准溶液(浓度为0.05mg/L)的超高效液相色谱图。其中：1-双去甲氧基姜黄素，2-去甲氧基姜黄素，3-姜黄素。图2为一种中华鳖血浆空白样品的超高效液相色谱图。图3为一种中华鳖肌肉空白样品的超高效液相色谱图。图4为一种中华鳖皮肤空白样品的超高效液相色谱图。图5为一种中华鳖血浆空白样品中3种姜黄素类化合物的加标样品(加标浓度为0.05mg/kg)超高效液相色谱图。其中：1-双去甲氧基姜黄素，2-去甲氧基姜黄素，3-姜黄素。图6为一种中华鳖肌肉空白样品中3种姜黄素类化合物的加标样品(加标浓度为0.05mg/kg)超高效液相色谱图。其中：1-双去甲氧基姜黄素，2-去甲氧基姜黄素，3-姜黄素。图7为一种中华鳖皮肤空白样品中3种姜黄素类化合物的加标样品(加标浓度为0.05mg/kg)超高效液相色谱图。其中：1-双去甲氧基姜黄素，2-去甲氧基姜黄素，3-姜黄素。图8为一种测定的双去甲氧基姜黄素标准溶液的标准曲线图。图9为一种测定的去甲氧基姜黄素标准溶液的标准曲线图。图10为一种测定的姜黄素标准溶液的标准曲线图。经本测定方法测定的中华鳖中3种姜黄素类化合物的超高效液相色谱图基线平稳，分离效果好，灵敏度高，重现性好。具体实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定中华鳖体内姜黄素类化合物含量的方法，其步骤是：A、中华鳖血浆、肌肉或皮肤组织中姜黄素类化合物采用4～5mL溶液A提取，涡旋28－32s，再加入0.5～1.0g试剂B，涡旋28－32s，7000r/min，离心4－6min，上层液体转移到至10mL离心管中，残渣重复提取一次，合并二次的提取液；B、将提取液置48－52℃氮吹仪上将提取液挥干；C、再用1mL溶液C溶解氮吹后的残渣，加入0～0.5mL试剂D，涡旋28－32s，8000r/min，离心4－6min，用移液器将上层液体弃去；D、用1mL注射器吸取下层液体过0.22μm聚醚砜水系滤头，过滤液放置到2mL进样瓶中，超高效液相色谱测定，获得中华鳖血浆、肌肉或皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的色谱图，通过对色谱图积分得到双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的峰面积；E、超高效液相色谱分析条件：流动相的有机相为试剂E，水相为溶液F，有机相与水相比为1:1～4:3；流速为0.3mL/min，柱温为28－32℃，检测波长为428nm，色谱柱：超高效液相色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18，进样量为5.0μL，采用双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素标准曲线方程计算中华鳖血浆、肌肉和皮肤中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量，获得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的色谱图，通过色谱图积分得出双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的峰面积，再将峰面积分别代入双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的标准曲线方程，计算出中华鳖血浆、肌肉和皮肤中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量；F、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素标准溶液的质量浓度分别为横坐标x1，x2，x3，双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的峰面积分别为纵坐标y1，y2，y3，绘制双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的标准曲线，获得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的准曲线方程；G、将测定中华鳖血浆、肌肉和皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的峰面积值代入标准曲线方程中，计算得到中华鳖血浆、肌肉和皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的含量；所述的溶液A是乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇、乙腈：含0.1％体积比乙酸、甲醇：含0.1％体积比乙酸、乙醇：含0.1％体积比乙酸、乙酸乙酯：含0.01％体积比乙酸、乙腈：含0.01％体积比乙酸、甲醇：含0.01％体积比乙酸、乙醇：含0.01％体积比乙酸中任一种液体试剂；所述的试剂B是无水硫酸钠、无水硫酸镁、固相萃取C18填料、固相萃取PSA填料中的任一种试剂；所述的溶液C是试剂E和溶液F按体积比1:1～4:3混合而成的溶液；所述的试剂D是正己烷、乙醚、乙酸乙酯、正庚烷、环己烷中的任一种试剂；所述的试剂E是乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇中的任一种试剂；所述的溶液F是0.1％体积比甲酸水溶液、0.1％体积比乙酸水溶液、0.01％体积比甲酸水溶液、0.01％体积比乙酸水溶液中的任一种试剂；所述的溶液C是试剂E与溶液F按体积比1:1～4:3混合而成的溶液。...
【技术特征摘要】
1.一种测定中华鳖体内姜黄素类化合物含量的方法，其步骤是：A、中华鳖血浆、肌肉或皮肤组织中姜黄素类化合物采用4～5mL溶液A提取，涡旋28－32s，再加入0.5～1.0g试剂B，涡旋28－32s，7000r/min，离心4－6min，上层液体转移到至10mL离心管中，残渣重复提取一次，合并二次的提取液；B、将提取液置48－52℃氮吹仪上将提取液挥干；C、再用1mL溶液C溶解氮吹后的残渣，加入0～0.5mL试剂D，涡旋28－32s，8000r/min，离心4－6min，用移液器将上层液体弃去；D、用1mL注射器吸取下层液体过0.22μm聚醚砜水系滤头，过滤液放置到2mL进样瓶中，超高效液相色谱测定，获得中华鳖血浆、肌肉或皮肤组织中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的色谱图，通过对色谱图积分得到双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的峰面积；E、超高效液相色谱分析条件：流动相的有机相为试剂E，水相为溶液F，有机相与水相比为1:1～4:3；流速为0.3mL/min，柱温为28－32℃，检测波长为428nm，色谱柱：超高效液相色谱柱ACQUITYUPLCBEHC18，进样量为5.0μL，采用双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素标准曲线方程计算中华鳖血浆、肌肉和皮肤中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量，获得双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的色谱图，通过色谱图积分得出双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的峰面积，再将峰面积分别代入双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的标准曲线方程，计算出中华鳖血浆、肌肉和皮肤中双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的含量；F、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素标准溶液的质量浓度分别为横坐标x1，x2，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永涛，余琳雪，杨红，艾晓辉，杨秋红，董靖，杨移斌，胥宁，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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