体外微器官及其相关用途制造技术

描述了包括具有特殊特性的分离的细胞群的微器官培养物。主题微器官培养物的突出特征包括在培养中维持相对长的一段时间的能力，以及保持促进例如类似于来源器官中存在的细胞－细胞和细胞－基质相互作用的器官微体系结构。本发明专利技术的微器官培养物可以用在将基因产物传递给受体受试者的方法中，来鉴定细胞增生和细胞分化试剂，以及祖和干细胞的鉴定和分离。另外，本发明专利技术的微器官培养物可以用于鉴定细胞增生、细胞分化和病毒传染性抑制剂的方法中。在其它实施方案中，微器官培养物可以用于移植。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外微器官及其相关用途。
技术介绍
在二十世纪五十年代早期完成了真核细胞培养。从那时开始，使用各种广泛的 培养基和明确的补充物，如生长因子和激素，以及不明确的补充物，如血清和其它身体 提取物已经培养了广泛的转化和原代细胞。例如，可通过很多细胞传代如核型双倍体细 胞或无限如建立的细胞系，常规培养由动物皮肤得到的成纤维细胞。然而，上皮细胞具 有与成纤维细胞不同的形态学和增生性能，更难于培养。而且，当上皮细胞和成纤维细 胞在相同培养物中生长，成纤维细胞通常使上皮细胞生长过度。虽然细胞二维生长是制备、观察和研究培养物中的细胞、允许细胞高速度增生 的方便方法，但是它缺乏体内整个组织的细胞-细胞和细胞-基质之间相互作用的特性。为了研究这种功能和形态学相互作用，少数研究者已经探究了使用三维基底 如胶原凝胶(Douglas et al.，(1980) In Vitro 16 306-312 ； Yang et al.，(1979) Proc.Natl. Acad.Sci. ； 76: 3401 ； Yang et al. (1980) Proc.Natl.Acad.Sci.77 2088-2092 ； Yang et al., (1981)Cancer Res.41 1021-1027)；纤维素海绵，单独(Leighton et al.，(1951) J.Natl Cancer Inst. 12 545-561)或胶原包裹的(Leighton et al., (1968) Cancer Res.28 286-296)；明胶海绵，Gelfoam(Sorouretal.，(1975) J.Neurosurg.43 742-749)。为了使上皮细胞以克隆竞争模式生长，已采用了各种培养条件。例如，已在致 命照射成纤维细胞的饲养层上(Rheinhardt etal. (1975) Cell6 331-343)和半合成胶原基质 上(美国专利5,282,859;欧洲专利申请0361957)培养了上皮细胞，尤其是皮肤上皮细胞 (角质细胞)。有些情况下，用于这种细胞生长的培养基可以添加生物提取物，包括垂体 提取物和血清，和生长补充物，如表皮生长因子和胰岛素(Bosseau etal. (1992) J.Dermatol. Sci 3 (2) 111-120 ；美国专利 5,292,655)。已经进行了皮肤在体外生长的很多尝试。这些尝试典型地包括将表皮中的角 质细胞与真皮中的成纤维细胞和脂肪细胞分离开来的步骤。分离之后，通常角质细胞 以允许分层表皮形成的方式生长。然而，这种方式制备的表皮缺乏毛囊和汗腺。而 且，在这种培养中，表皮和真皮之间的天然关系不再保留。已经采取的培养方法包括 角质细胞在无活力的成纤维细胞上生长(Rheinwald etal. (1975) Cell 6 : 331-343)或将角 质细胞放置于合成或由表皮胶原和成纤维细胞的可替换来源得到的胶原和成纤维细胞的 真皮基底上(Sugihara et al. (1991) Cell.Dev.Biol.27 142-146 ； Parenteau et al. (1991) J.Cell Biochem.45(3) 245-251)。然而，有些情况下，不实施角质细胞的分离，整个器官放置 于培养中。体外培养器官的尝试限于在含血清的培养基中培养器官(Li et al. (1991)Proc.4Natl.Acad.Sci.88 (5) 108-112)。多数现存体外表皮模型缺乏毛囊、汗腺和皮脂腺(对于表皮细胞培养的综述， 见 Coulomb et al. (1992)Pathol.Biol.Paris 40(2) 139-146)。例外的包括 Li et al.((1992) Proc.Natl.Acad.Sci 89 8764-8768)的凝胶支撑的皮肤模型，其中直径&5mm2和2.0mm厚的皮肤外植块，在含血清的培养基存在下，活力保持几天。除了细胞损害的缺陷外，生物反应器和培养哺乳动物细胞的其它方法提供允许 细胞装配为组织，模拟三维空间形式的完整生物体内真实组织的条件的能力也非常有 限。由于类似原因，传统组织培养方法限制了培养组织表现出认为对哺乳动物细胞分化 以及研究和制药兴趣的专门生物活性分子分泌很关键的功能高度专门化或分化状态的能 力。与微生物不同，较高级生物如哺乳动物的细胞自身形成高级的多细胞组织。尽管不 知道这种自身装配的确切机制，但是在研究至此的情况下，已经发现细胞发育为组织依 赖于细胞彼此(相同或不同细胞类型)的定位或其它固定基底和/或某些底物(因子)的 存在或缺乏，如激素、自分泌或旁分泌。总之，常规培养方法不能同时达到足够低的剪 切压力，足够的三维空间自由度，和临界细胞相互作用(彼此或底物)足够长的时期，以 允许体内组织结构的极佳建模。因此，需要在培养中产生和维持器官各部分的体外方法，其中培养的细胞天然 的细胞间关系保持延长一段时间。模拟整个组织在体内发现的细胞分化、细胞增生和细 胞功能的组织和器官模型将对理解器官维持健康状态和由此异常事件如何可以被逆反的 机制有实用性。
技术实现思路
本专利技术提供了满足上述需要的体外微器官培养物。微器官培养物主题的突出特 征包括在培养中维持相对长的一段时间的能力，如，至少大约二十四小时，优选至少七 天或更长，以及保持器官微体系结构(microarchitecure)的能力，它促进例如类似于来源 器官中发生的细胞_细胞和细胞_基质的相互作用。典型地，微器官培养物的细胞群中至少一个细胞具有增生能力。微器官培养物 中的细胞群总体上可以处于平衡状态，即细胞群中细胞增生与细胞损失的比率大约是1， 或微器官培养物中的细胞增生速度可以大于它们损失，导致细胞群中细胞增生与细胞损 失的比率大于1，如肿瘤组织得到的细胞群，或如，在外植块中被诱导增生的祖细胞群。可分离微器官培养物细胞的优选器官包括淋巴器官，如胸腺和脾脏；消化道器 官，如肠、肝脏、胰腺、胆囊和胆管；肺；生殖器官，如前列腺和子宫；乳房，如乳 腺；皮肤；泌尿道器官，如膀胱和肾脏；角膜；和血液相关器官如骨髓。在某些实施方 案中，分离的微器官培养物细胞群可以包裹在聚合装置中，如细胞或细胞产物如基因产 物传递给受试者。本专利技术也涉及本专利技术的微器官培养物中分离的条件培养基。在本专利技术的一个实施方案中，微器官培养物包括细胞群，它是器官的一部分。 优选，微器官外植块包括上皮和结缔组织细胞。在本专利技术的一个实施方案中，器官外植 块得自胰腺，如细胞群的微体系结构基本上与该外植块所来源的最初胰腺的微体系结构 相同，并包括胰腺上皮细胞，如胰岛细胞，和胰腺结缔组织细胞。在本专利技术的另一个实施方案中，微器官外植块得自皮肤，如细胞群的微体系结构基本上与体内皮肤的微体系结构相同，并包括皮肤上皮，如表皮细胞，和皮肤结缔组 织细胞，如真皮细胞。皮肤外植块得到的微器官培养物与可以包括支撑表皮细胞的基底 层，包括真皮细胞的细胞外基质，和至少一个内陷，如至少一个毛囊和腺体。本专利技术的另一个实施方案中，微器官培养物包括病毒感染的分离的细胞群，如 肝炎病毒，如乙型肝炎或丙型肝炎，或人乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达至少一个重组基因产物的基因修饰的微器官外植块，该微器官外植块包括细胞群，该微器官外植块维持得到该器官的微体系结构以及同时具有经选择以使得允许足够营养和气体扩散到该微器官外植块中的细胞且细胞废物从微器官外植块扩散出去的大小，且其中至少一些所述细胞表达至少一个重组基因产物。

【技术特征摘要】
1.表达至少一个重组基因产物的基因修饰的微器官外植块，该微器官外植块包括细 胞群，该微器官外植块维持得到该器官的微体系结构以及同时具有经选择以使得允许足 够营养和气体扩散到该微器官外植块中的细胞且细胞废物从微器官外植块扩散出去的大 小，且其中至少一些所述细胞表达至少一个重组基因产物。2.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，其中所述的至少一个重组基因产物选自重 组蛋白和重组功能性RNA分子。3.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述的重组蛋白正常由微器官外植块 所来源的器官产生的。4.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述重组蛋白正常不是由微器官外植 块所来源的器官产生的。5.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述的重组蛋白是标记蛋白。6.权利要求2的基因修饰的微器官外植块，其中所述的重组蛋白选自胰岛素、淀粉 酶、蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸 酶、甘油三酯酶、磷脂酶A2、弹性蛋白酶、淀粉酶、凝血因子、UDP葡萄糖醛酸转移 酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、细胞色素p450酶、腺苷脱氨酶、血清胸腺因子、胸腺体液因 子、胸腺生成素、胸腺素α 、生长激素、促生长因子、集落刺激因子、红细胞生成素、 表皮生长因子、肝红细胞生成因子(肝生成素)、肝细胞生长因子、白介素、反生长因 子、成纤维细胞生长因子、β家族的转化生长因子、胃泌素、胰泌素、缩胆囊素、生长 抑素、P物质和转录因子。7.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，可在培养中维持至少大约二十四小时。8.权利要求1的基因修饰的微器官外植块，具有公式l/x+1/a> 1.5mm 1为特征的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：EN米特拉尼，
申请(专利权)人：耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司，
类型：发明
国别省市：IL