一种β－葡聚糖酶的生产方法技术

一种β－葡聚糖酶的生产方法，利用李氏木霉作为菌种，以微晶纤维素、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸铵和碳酸钙为原料，进行液体深层发酵生产β－葡聚糖酶，发酵滤液经板框过滤，得到滤渣与β－葡聚糖酶液；所得β－葡聚糖酶液再经过超滤浓缩和喷雾干燥后得粉状β－葡聚糖酶产品；其特征在于所得滤渣全部用于替代微晶纤维素作为主原料，重新进行液体深层发酵生产β－葡聚糖酶；循环反复，对滤渣重复利用一至五次；六次滤渣用于饲料添加剂。每次得到的滤渣在８小时之内进入下一步骤。重复利用菌渣发酵生产的β－葡聚糖酶的发酵主要技术指标与首次使用微晶纤维素的发酵指标相当。它极大的降低了生产成本，相当于投一罐主原料生产６罐产品，产品主原料成本降低８３．３％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种β -葡聚糖酶(β -glucanase)的生产方法，属于生物 酶制剂生产

技术介绍
β _葡聚糖酶是非淀粉类水解酶，是水解β _葡聚糖分子中的(1 — 3) 和(1 — 4)-β糖苷键，使之降解为小分子，失去亲水性和黏性的产物。葡聚糖酶广泛应 用于啤酒、饲料、食品、医药、环保等工业，随着国民经济的快速发展，其用途越来越广。β -葡聚糖酶主要采用微生物发酵法生产；通常采用固体发酵法和液体深层发酵 法。固体发酵法应用较早，由于其劳动强度大、控制难度大、产品质量尤其是卫生指标不稳 定等原因，已逐步被液体深层发酵法取代；但液体深层发酵法投资大，生产成本高，其中主 原料占到生产成本的60% ；投一罐主原料仅仅发酵一次，所产生的滤渣少量用来作饲料添 加剂，大部分废弃。由于液体深层发酵法生产葡聚糖酶存在成本偏高问题，导致市场售 价高，直接影响市场开发与产品应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重复利用滤渣，降低葡聚糖酶生产成本 的β-葡聚糖酶的生产方法。本专利技术实现上述目的所采取的技术方案是一种β -葡聚糖酶(β-glucanase)的生产方法，利用李氏木霉 (Trichodermareesei)作为菌种，以微晶纤维素、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸铵和碳酸钙为原 料，进行液体深层发酵生产β-葡聚糖酶，发酵滤液经板框过滤，得到滤渣与β-葡聚糖酶 液；所得β-葡聚糖酶液再经过超滤浓缩和喷雾干燥后得粉状β-葡聚糖酶产品；所得滤 渣全部用于替代微晶纤维素作为主原料，重新进行液体深层发酵生产葡聚糖酶；循环 反复，滤渣重复利用一至五次；具体包括下述步骤Α、菌种制备与扩大培养Α. 1将李氏木霉试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的以PDA为培养基的 500ml茄瓶中，pH5. 0 5. 8 ；灭菌条件121°C保温30分钟；28°C 30°C培养5 7天备 用；A. 2用6立方米种子罐对菌种扩大培养将工业级的微晶纤维素58 62kg、玉米浆73 78kg、磷酸二氢钾17 19kg和硫 酸铵14. 5 15. 5kg分别投入6立方米种子罐内，用自来水定容到2. 8 3. 2立方米；搅拌 均勻；然后用蒸汽直接灭菌，120 121°C保温30 33分钟，再降温到30 32°C ；接入按 步骤A. 1所得的6瓶500ml茄瓶的李氏木霉菌种；在风量为1 0. 6、温度为30°C 32°C， 罐压力为0. 06 0. OSMpa条件下培养32 36小时，得扩大培养的李氏木霉菌种备用；B、用60立方米发酵罐发酵生产β “葡聚糖酶B. 1将工业级的微晶纤维素2300 2450kg、玉米浆950 1050kg、磷酸二氢钾 230 250kg、硫酸铵190 210kg与碳酸钙19 21kg分别投入60立方米发酵罐内，用 自来水定容到39 42立方米；搅拌均勻，PH4. 0 ；然后用蒸汽直接灭菌，113 115°C保温 30 33分钟，再降温到29 31°C ；将步骤Α. 2所得扩大培养的李氏木霉菌种全部接入； 在风量比为1 0. 17 0. 18、温度为27°C 29°C，罐压力为0.06 0.08Mpa条件下培养138 148小时，得发酵液；利用板框过滤机将发酵液进行固液分离，得一次滤渣与β _葡 聚糖酶清液；所述风量比是一立方米发酵液与每分钟所需要的进气量之比；B. 2将步骤B. 1所得的含水量为42 50%的全部一次滤渣，玉米浆880 930kg， 磷酸二氢钾190 210kg，硫酸铵152 168kg与碳酸钙15. 5 16. 5kg分别投入60立方米 发酵罐内，用自来水定容到39 42立方米；搅拌均勻，PH4. 0，然后用蒸汽直接灭菌，113 115°C保温30 33分钟，再降温到29 31°C，接入按步骤A. 2制备的另一罐6立方米种 子罐扩大培养的李氏木霉菌种，在风量为1 0. 17 0. 18、温度为27°C 29°C，罐压力为 0. 06 0. OSMpa条件下培养138 148小时，得发酵液；利用板框过滤机将发酵液进行固 液分离，得二次滤渣与β-葡聚糖酶清液。C、β-葡聚糖酶的提纯将步骤B. 1或B. 2所得β -葡聚糖酶清液采用分子量为10000道尔顿的超滤膜进行浓缩至9 11倍；然后采用压力式喷雾塔喷雾干燥；工艺条件进口温度125 135°C， 出口温度55 60°C，干燥所得即为粉状β -葡聚糖酶产品。为了随时掌握所生产的β -葡聚糖酶的质量技术指标，本专利技术还包括步骤D、β-葡聚糖酶的检测酶活力单位定义在测定条件下，每小时水解β-葡聚糖产生Img还原糖所需酶量 定义为一个酶活力单位(U)。酶活力检测方法采用DNS法。为了充分利用微晶纤维素的有效成分，更多地获取葡聚糖酶，本专利技术的步骤 B. 2的后面还包括步骤B. 3将步骤B. 2所得的含水量为42 50%的全部二次滤渣，玉米浆840 920kg， 磷酸二氢钾152 168kg，硫酸铵133 147kg，碳酸钙15. 5 16. 5kg分别投入60立方米 发酵罐内，用自来水定容到39 42立方米；搅拌均勻，其它工艺条件按步骤B. 2，得三次滤 渣与β-葡聚糖酶清液。为了更充分地利用微晶纤维素的有效成分，更多地获取葡聚糖酶，本专利技术的 步骤B. 3的后面还包括步骤B. 4将步骤B. 3所得的含水量为42 50%的全部三次滤渣，玉米浆820 900kg， 磷酸二氢钾133 147kg，硫酸铵114 126kg，碳酸钙13. 5 14. 5k kg分别投入60立方 米发酵罐内，用自来水定容到39 42立方米；搅拌均勻，其它工艺条件按步骤B. 2，得四次 滤渣与β-葡聚糖酶清液。为了进一步地利用微晶纤维素的有效成分，更多地获取葡聚糖酶，本专利技术的 步骤B. 4的后面还包括步骤B. 5将步骤B. 4所得的含水量为42 50%的全部四次滤渣，玉米浆790 820kg， 磷酸二氢钾117 126kg，硫酸铵95 105kg，碳酸钙11. 5 12. 5k kg分别投入60立方 米发酵罐内，用自来水定容到39 42立方米；搅拌均勻，其它工艺条件按步骤B. 2，得五次 滤渣与β-葡聚糖酶清液。为了更进一步地利用微晶纤维素的有效成分，进一步获取葡聚糖酶，本专利技术 的步骤B. 5的后面还包括步骤B. 6将步骤B. 5所得的含水量为42 50%的全部五次滤渣，玉米浆770 830kg，磷酸二氢钾95 105kg，硫酸铵76 85kg，碳酸钙9. 5 10. 5k kg分别投入60立方米发 酵罐内，用自来水定容到39 42立方米；搅拌均勻，其它工艺条件按步骤B. 2，得六次滤渣 与β-葡聚糖酶清液。同理，需要对步骤B. 3至B. 6所得的β -葡聚糖酶清液提纯，将步骤B. 3至B. 6所 得的β-葡聚糖酶清液采用分子量为10000道尔顿的超滤膜进行浓缩至9 11倍；然后采 用压力式喷雾塔喷雾干燥得粉状葡聚糖酶产品；工艺条件进口温度125 135°C，出 口温度55 60°C。各步骤所使用的滤渣是不超过8小时的新鲜滤渣。为了消除发酵过程中所产生的泡沫，在步骤B. 1至步骤B. 6的60立方米发酵罐内 还加入5 6kg的棉油作为消泡剂。第六次滤渣经干燥至水分小于8%本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β－葡聚糖酶的生产方法，利用李氏木霉作为菌种，以微晶纤维素、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸铵和碳酸钙为原料，进行液体深层发酵生产β－葡聚糖酶，发酵滤液经板框过滤，得到滤渣与β－葡聚糖酶液；所得β－葡聚糖酶液再经过超滤浓缩和喷雾干燥后得粉状β－葡聚糖酶产品；其特征在于所得滤渣全部用于替代微晶纤维素作为主原料，重新进行液体深层发酵生产β－葡聚糖酶；循环反复，对滤渣重复利用；包括下述步骤：Ａ、菌种制备与扩大培养Ａ．１将李氏木霉试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的以ＰＤＡ为培养基的５００ｍｌ茄瓶中，ｐＨ５．０～５．８；灭菌条件：１２１℃保温３０分钟；２８℃～３０℃培养５～７天备用；Ａ．２用６立方米种子罐对菌种扩大培养将工业级的微晶纤维素５８～６２ｋｇ、玉米浆７３～７８ｋｇ、磷酸二氢钾１７～１９ｋｇ和硫酸铵１４．５～１５．５ｋｇ分别投入６立方米种子罐内，用自来水定容到２．８～３．２立方米；搅拌均匀；然后用蒸汽直接灭菌，１２０～１２１℃保温３０～３３分钟，再降温到３０～３２℃；接入按步骤Ａ．１所得的６瓶５００ｍｌ茄瓶的李氏木霉菌种；在风量为１∶０．６、温度为３０℃～３２℃，罐压力为０．０６～０．０８Ｍｐａ条件下培养３２～３６小时，得扩大培养的李氏木霉菌种备用；Ｂ、用６０立方米发酵罐发酵生产β－葡聚糖酶Ｂ．１将工业级的微晶纤维素２３００～２４５０ｋｇ、玉米浆９５０～１０５０ｋｇ、磷酸二氢钾２３０～２５０ｋｇ、硫酸铵１９０～２１０ｋｇ与碳酸钙１９～２１ｋｇ分别投入６０立方米发酵罐内，用自来水定容到３９～４２立方米；搅拌均匀，ＰＨ４．０；然后用蒸汽直接灭菌，１１３～１１５℃保温３０～３３分钟，再降温到２９～３１℃；将步骤Ａ．２所得扩大培养的李氏木霉菌种全部接入；在风量为１∶０．１７～０．１８、温度为２７℃～２９℃，罐压力为０．０６～０．０８Ｍｐａ条件下培养１３８～１４８小时，得发酵液；利用板框过滤机将发酵液进行固液分离，得一次滤渣与β－葡聚糖酶清液；Ｂ．２将步骤Ｂ．１所得的含水量为４２～５０％的全部一次滤渣，玉米浆８８０～９３０ｋｇ，磷酸二氢钾１９０～２１０ｋｇ，硫酸铵１５２～１６８ｋｇ与碳酸钙１５．５～１６．５ｋｇ分别投入６０立方米发酵罐内，用自来水定容到３９～４２立方米；搅拌均匀，ＰＨ４．０，然后用蒸汽直接灭菌，１１３～１１５℃保温３０～３３分钟，再降温到２９～３１℃，接入按步骤Ａ．２制备的另一罐６立方米种子罐扩大培养的李氏...

【技术特征摘要】
1.一种葡聚糖酶的生产方法，利用李氏木霉作为菌种，以微晶纤维素、玉米浆、磷 酸二氢钾、硫酸铵和碳酸钙为原料，进行液体深层发酵生产β “葡聚糖酶，发酵滤液经板框 过滤，得到滤渣与β _葡聚糖酶液；所得β -葡聚糖酶液再经过超滤浓缩和喷雾干燥后得粉 状葡聚糖酶产品；其特征在于所得滤渣全部用于替代微晶纤维素作为主原料，重新进 行液体深层发酵生产β“葡聚糖酶；循环反复，对滤渣重复利用；包括下述步骤Α、菌种制备与扩大培养Α. 1将李氏木霉试管斜面菌种在无菌条件下转入已制备好的以PDA为培养基的500ml 茄瓶中，pH5. 0 5. 8 ；灭菌条件121°C保温30分钟；28°C 30°C培养5 7天备用；A.2用6立方米种子罐对菌种扩大培养将工业级的微晶纤维素58 62kg、玉米浆73 78kg、磷酸二氢钾17 19kg和硫酸 铵14. 5 15. 5kg分别投入6立方米种子罐内，用自来水定容到2. 8 3. 2立方米；搅拌均 勻；然后用蒸汽直接灭菌，120 121°C保温30 33分钟，再降温到30 32°C ；接入按步 骤A. 1所得的6瓶500ml茄瓶的李氏木霉菌种；在风量为1 0. 6、温度为30°C 32°C，罐 压力为0. 06 0. OSMpa条件下培养32 36小时，得扩大培养的李氏木霉菌种备用；B、用60立方米发酵罐发酵生产β-葡聚糖酶B. 1将工业级的微晶纤维素2300 2450kg、玉米浆950 1050kg、磷酸二氢钾230 250kg、硫酸铵190 210kg与碳酸钙19 21kg分别投入60立方米发酵罐内，用自来水定 容到39 42立方米；搅拌均勻，PH4. 0 ；然后用蒸汽直接灭菌，113 115°C保温30 33 分钟，再降温到29 31°C ；将步骤Α. 2所得扩大培养的李氏木霉菌种全部接入；在风量为 1 0. 17 0. 18、温度为27°C 29°C，罐压力为0. 06 0. 08Mpa条件下培养138 148小 时，得发酵液；利用板框过滤机将发酵液进行固液分离，得一次滤渣与β “葡聚糖酶清液；B、2将步骤B. 1所得的含水量为42 50%的全部一次滤渣，玉米浆880 930kg，磷 酸二氢钾190 210kg，硫酸铵152 168kg与碳酸钙15. 5 16. 5kg分别投入60立方米 发酵罐内，用自来水定容到39 42立方米；搅拌均勻，PH4. 0，然后用蒸汽直接灭菌，113 115°C保温30 33分钟，再降温到29 31°C，接入按步骤A. 2制备的另一罐6立方米种 子罐扩大培养的李氏木霉菌种，在风量为1 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙维国，李统锋，顾克才，丁少明，
申请(专利权)人：白银赛诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]