具有降低的葡萄糖抑制作用的纤维素酶变体制造技术

提供了一种家族６纤维素酶变体酶，其包含选自以下的一个或多个氨基酸替换：１０３位的碱性、极性或非极性氨基酸，１３６位的缬氨酸或异亮氨酸，１８６位的酪氨酸，３６５位的谷氨酸或谷氨酰胺以及４１０位的谷氨酰胺（所述位置通过将亲本家族６与ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１进行比对来确定）。本发明专利技术还提供了包含编码所述家族６纤维素酶变体的ＤＮＡ序列的遗传构建体及经遗传修饰的微生物。本发明专利技术的家族６纤维素酶相比于亲本家族６纤维素酶，显示出葡萄糖抑制作用的降低。这种纤维素酶提供了多种工业上的应用，例如水解经过预处理的木质纤维素原料，该应用需要当存在能够抑制亲本纤维素酶活性的葡萄糖浓度时保持纤维素酶活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请要求享受2008年I月18日提交的在先临时申请No 61/022, 101的优先权。本专利技术涉及纤维素酶变体。更具体地说，本专利技术涉及降低了葡萄糖抑制作用的家族6纤维素酶变体。本专利技术还涉及包含编码家族6纤维素酶变体的核苷酸序列的遗传构建体、由宿主菌株生产家族6纤维素酶变体的方法，以及家族6纤维素酶变体在纤维素水解中的用途。
技术介绍
纤维素是一种由β -(I — 4)糖苷键连接的无分支的葡萄糖聚合物。纤维素链之间可通过氢键彼此相互作用，形成具有高机械强度和化学稳定性的结晶固体。纤维素链必须解聚成葡萄糖和短的低聚糖，然后微生物(例如在乙醇生产中使用的发酵微生物)才能将其用作代谢燃料。纤维素酶催化原料中纤维素的水解(水解β-(1，4)- -葡聚糖连接)而形成产物，例如葡萄糖、纤维二糖或其他纤维低聚糖。纤维素酶作为常用术语意指多酶混合物，包括可以通过大量植物和微生物生产的外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β_葡糖苷酶(PG)等。里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶包括CBHl ( 一般称作 Cel7A)、CBH2 (Cel6A)、EG1 (Cel7B)、EG2 (Cel5)、EG3 (Cel 12)、EG4 (Cel61A)、EG5 (Cel45A)、EG6 (Cel74A) ,CipU Cip2、β -葡糖苷酶(包括如 Cel3A)、乙酰木聚糖酯酶、β-甘露聚糖酶及纤维素膨胀因子(swollenin)。纤维素酶协同发挥作用，将纤维素水解成葡萄糖。CBHl和CBH2作用于纤维素链的相反末端(Barr等，1996)，而内切葡聚糖酶作用于纤维素的内部位点。上述酶的初级产物是纤维二糖，其进一步被一种或多种的β-葡糖苷酶水解为葡萄糖。纤维素酶水解不溶性纤维素底物的酶促水解动力学不遵循简单的米氏动力学(Zhang等，1999)。具体来说，在水解反应中增加纤维素酶的剂量不会在给定时间内线性地提高所产生的葡萄糖量。同时，随着纤维素水解的进行，反应速率会显著地降低(Tolan，2002)。现在已经提出了几种原因来解释反应速率的降低；主要的假说包括底物异质性(Nidetsky 和 Steiner, 1993 ；Zhang 等，1999)、酶失活(Caminal 等，1985 ；Converse 等，1988 ；Gusakov 和 Sinitsyn, 1992 ；Eriksson 等，2002)，以及产物抑制(Lee 和 Fan, 1983 ；Caminal 等，1985 ；Holtzapple 等，1990 ；Gusakov 和 Sinitsyn, 1992 ；Eriksson 等，2002;Gruno 等，2004)。人们早已认识到了催化反应的产物对酶的抑制作用；上述现象已经被Henr1、Michaelis及Menten等酶学领域的先驱们所认知(Frieden和Walter, 1963)。产物抑制的性质可能是竞争，由于产物与底物竞争与酶形成相同的相互作用，但也可能存在其他形式的抑制作用。事实上 ，由于纤维素不可溶性，并且难于将其作为动力学研究的底物，因此关于纤维素酶体系中的抑制性质有许多矛盾的结论(Holtzapple等，1990及其参考文献)。纤维二糖水解酶受到其直接产物纤维二糖的抑制作用，并且在较低的程度上受到纤维二糖被β-葡糖苷酶进一步水解的产物葡萄糖的抑制。一种降低纤维素酶抑制作用的技术是提高体系中β -葡糖苷酶的量(美国专利N0.6，015，703)，因为纤维二糖对纤维素酶的抑制作用比葡萄糖更强(Holtzapple等，1990 ；Teleman等，1995)。可以通过推理性设计或随机进行的DNA诱变来改变蛋白质的一级序列，以降低抑制作用。例如，通过推理性设计以Cel5A( —种内切葡聚糖酶)中的Y245残基为靶标进行诱变，提高了其纤维二糖抑制常数(美国专利公开号 N0.2003/0054535)。改造Cel6A(也被称作纤维二糖水解酶II或CBH2，里氏木霉(也称作红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))纤维素酶系中一种主要的纤维二糖水解酶)以获得期望特性的报道相对很少。St-Pierre等(美国专利公开号N0.2008/0076152)显示，将里氏木霉Cel6A序列的第231、305、410及413位等同位置的天然氨基酸替换成丝氨酸或苏氨酸(第231及305位)、谷氨酰胺或天冬酰胺(第410位)或脯氨酸(第413位)可以提高家族6纤维素酶的热稳定性、嗜热性和/或嗜碱性。Wohlfahrt等已经通过诱变E107、D170及D366位残基而形成酰胺羧酸对，从而提高了蛋白质的稳定性(美国专利公开号N0.2004/0152872)。推理性设计也适用于相关的纤维二糖水解酶(来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的Cel6B),以降低纤维二糖的抑制作用(Zhang等，2000)。已显不，Cel6B中等同于Cel6A序列中W269、H266及E399的残基的突变可以降低纤维二糖的抑制作用，但是对结晶纤维素的活性有显著损失。另一种方法基于对来自不同物种的Cel6A序列进行比对而产生的共有序列(美国专利公开号N0.2006/0205042)，鉴定了与提高热稳定性相关的38个氨基酸(具体是:V94、P98、Gl 18、M120、M134、T142、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、1212、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、1333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S390、F411、S413、A416、Q426 及 A429)。作者推测，这些突变也可能影响产物抑制和/或酶的加工能力，但没有提供基于建模的数据或具体假说而将这些特性改变与所述残基关联起来。共同的方法是设计产生提高热力学稳定性的蛋白变体(Steipe，2004)，但并不能预见到其他任何生化特性的提高。虽然之前已经描述了纤维素酶组合物，但是仍然需要提供一种新的改进组合物，用于将纤维素转化为可发酵的糖，以及用于纤维素材料加工相关的领域，例如制浆和造纸、纺织和动物饲料。具有提高性能的纤维素酶能降低生产成本，并且与类似的化学和/或物理方法相比通常能获得巨大的环境益处。例如，从纤维素生产燃料乙醇提供了巨大的环境益处和经济效益。与汽油相比，使用乙醇作为燃料显著降低了净碳排放量，这通过将燃烧过程中释放的二氧化碳固定成生物质生成，作为进一步生产乙醇的原料来实现。利用农业生物质作为原料还可以刺激农村经济，并减少对外国石油的依赖。用纤维素而不是淀粉(例如玉米乙醇)或糖来生产乙醇，这具有避免与人类和动物食品生产相竞争的额外好处。据美国农业部和能源部估算，作为世界上最大的石油市场，美国有30%的运输用燃料可以通过使用纤维素燃料进行替代，而不影响食品收成(Perlack等，2005)。此外，由于生产纤维素生物质所需的能量输入低，据估计，使用纤维素乙醇与汽油相比会降低88%的净温室气体排放，而使用玉米生产乙醇仅降低18% (Farrell等，2006)。
技术实现思路
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【技术保护点】
一种家族６纤维素酶变体，其包含选自以下的一个或多个氨基酸替换：１０３位的碱性、非极性或脯氨酸残基（Ｘ１０３Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｍ）；１３６位的缬氨酸或异亮氨酸残基（Ｘ１３６Ｖ、Ｉ）；１８６位的酪氨酸或赖氨酸残基（Ｘ１８６Ｙ、Ｋ）；３６５位的酸性、谷氨酰胺或丝氨酸残基（Ｘ３６５Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｓ）；和４１０位的丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸残基（Ｘ４１０Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｓ），所述位置通过将亲本家族６纤维素酶与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所定义之里氏木霉Ｃｅｌ６Ａ氨基酸序列进行比对来确定，其中所述家族６纤维素酶变体与其来源的亲本家族６纤维素酶相比显示出至少低约１．４倍的葡萄糖抑制作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯A拉维涅，克里斯多佛MD希尔，安妮特伦布莱，帕特里克ST皮埃尔，约翰J托马舍克，
申请(专利权)人：艾欧基能源公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]