本发明专利技术公开了一种利用高活性生物酶合成Ｄ－苯丙氨酸的制备工艺，其步骤为：利用多元培养基培养Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ Ｎｏ．１菌种，絮凝收集菌丝体，将收集的菌丝体投入转化罐，同时投入５苄基海因，５苄基海因重量为絮凝前发酵液总重量的１／５－１／６；转化罐采用氮气保护，压力为０．１－０．２公斤，转化温度９０℃，搅拌速度１２０转／分钟，ｐＨ值保持在８，转化时间２４小时；常规收集转化清液，经后提炼、浓缩蒸发、结晶、离心、干燥得成品。本发明专利技术中，菌种发酵后可产生高酶活的Ｄ－海因酶及Ｎ－氨甲酰基酶。而且经适宜的转化温度转化，酶对底物的转化率稳定在９９－１００％，进而使Ｄ－苯丙氨酸的产品收率可达８４－８６％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及使用酶制备含氮有机化合物的方法，具体地说是利用高活性生物酶合 成D-苯丙氨酸的制备工艺。
技术介绍
D-苯丙氨酸是重要的非天然氨基酸，在医药和食品领域具有重要的应用价值，是 国际上目前最具发展前景的II型糖尿病治疗药物那格列奈(NategliniDe，又称Marlix) 的前体，显示了极好的应用前景。它又是治疗肿瘤药物的中间体，另外，D-苯丙氨酸还用于 减肥等保健品。而目前D-苯丙氨酸的生产主要采用拆分法工艺，其具有生产规模小、收率 低、成本高，难以满足国内外市场的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种利用高活性生物酶合成D-苯丙氨酸的制备工艺，以 合成光学纯度高，产品质量好的D-苯丙氨酸。本专利技术是这样实现的(1)多元培养基培养Psudomonas No. 1菌种a) 一级发酵发酵液中按重百分比计含液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0. 3%，硫酸 铵0. 1-0. 12%，PH值为6. 7-7. 0，温度35_37°C，培养时间20小时；b) 二级发酵发酵液中按重百分比计含液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0. 3%，硫酸 铵0. 1-0. 12%，硫酸镁0. 05-0. 06%，PH值为6. 7-7. 0，温度35-37°C，培养时间20小时；c)三级发酵发酵液中按重百分比计含液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0. 3%，硫酸 铵 0. 1-0. 12%，硫酸镁 0. 05-0. 06%，氯化钴 0. 01-0. 02%，诱导剂 2. 0%，ΡΗ 值为 6. 7-7. 0， 温度35-37°C，培养时间16小时；(2)絮凝收集菌丝体，将收集的菌丝体投入转化罐，同时投入5苄基海因，5苄基海 因重量为絮凝前发酵液总重量的1/5-1/6 ；转化罐采用氮气保护，压力为0. 1-0. 2公斤，转 化温度90°C，搅拌速度120转/分钟，PH值保持在8，转化时间M小时；(3)常规收集转化清液，经后提炼、浓缩蒸发、结晶、离心、干燥得成品。在上述技术方案下，本专利技术可以这样实现在三级发酵中，培养16小时后检测发酵液，待酶活1. 0，生物量0. 8时进行絮凝并 收集菌丝体。转化时分批加入5苄基海因，维持底物浓度按重百分比计在3-4%。本专利技术的发酵培养基中提供了适量的氮源和无机盐以及适宜的发酵工艺，使得 Psudomonas No. 1菌种发酵后可产生高酶活的D-海因酶及N-氨甲酰基酶。由于两种酶的 酶活均可达1. 0，生物量可达0. 8，而且选用了适宜的转化温度，因而使得酶对底物的转化 率稳定在99-100%，进而使D-苯丙氨酸的产品收率可达84-86%。具体实施例方式本专利技术实施方式中所有百分比均为重量百分比。实施例1(1)以多元培养基培养I^udomonas No. 1菌种得到发酵液。各级发酵液消毒工艺 消毒蒸汽温度120-130°C，压力1.2-1. 5公斤/cm2，消毒时间为30分钟。三级发酵的工艺 控制条件分别为a、一级发酵发酵液中液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0. 3%，硫酸铵0. 1%，余量为 水。使用盐酸，液碱调节PH值为6. 7-7.0。发酵温度35-37°C，搅拌转速60转/分钟，培养 时间20小时；b、二级发酵发酵液中液糖2 %，玉米浆2 %，氯化钠0. 3 %，硫酸铵0. 1 %，硫酸镁 0.06%，余量为水。使用盐酸，液碱调节PH值为6. 7-7.0。发酵温度35-37°C，搅拌转速60 转/分钟，培养时间20小时；c、三级发酵发酵液中液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0.3%，硫酸铵0. 1%，硫酸镁 0. 05%，氯化钴0. 02%，诱导剂甲硫乙基海因2. 0%，余量为水。使用盐酸，液碱调节PH值 为6. 7-7. 0。发酵温度35-37°C，搅拌转速60转/分钟，培养时间16小时。(2)检测发酵液，酶活为1.0，生物量0.8时向发酵液内加入絮凝剂聚丙烯酰胺 2%，收集菌丝体，将收集的菌丝体投入转化罐，同时投入5苄基海因。底物5苄基海因总重 量为絮凝前发酵液总重量的1/5-1/6。转化过程中5苄基海因分批投入，保持底物浓度4%。 转化罐采用氮气保护，压力为0. 1-0. 2公斤，转化温度90°C，搅拌速度120转/分钟，PH值 保持在8，转化时间M小时，底物5苄基海因转化率99%。(3)常规收集转化清液，依次经后提炼、浓缩蒸发、结晶、离心、干燥得成品，D-苯 丙氨酸的产品收率可达85%。实施例2(1)以多元培养基培养I^udomonas No. 1菌种得到发酵液。各级发酵液消毒工艺 消毒蒸汽温度120-130°C，压力1.2-1. 5公斤/cm2，消毒时间为30分钟。三级发酵的工艺 控制条件分别为a、一级发酵发酵液中液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0. 3%，硫酸铵0. 1%，余量为 水。使用盐酸，液碱调节PH值为6. 7-7.0。发酵温度35-37°C，搅拌转速60转/分钟，培养 时间20小时；b、二级发酵发酵液中液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0.3%，硫酸铵0. 12%，硫酸镁 0.05%，余量为水。使用盐酸，液碱调节PH值为6. 7-7.0。发酵温度35-37°C，搅拌转速60 转/分钟，培养时间20小时；C、三级发酵发酵液中液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0. 3%，硫酸铵0. 1%，硫酸镁 0. 05%，氯化钴0. 01%，诱导剂甲硫乙基海因2. 0%，余量为水。使用盐酸，液碱调节PH值 为6. 7-7. 0。发酵温度35-37°C，搅拌转速60转/分钟，培养时间16小时。(2)检测发酵液，酶活为1.0，生物量0.8时向发酵液内加入絮凝剂聚丙烯酰胺 2%，收集菌丝体，将收集的菌丝体投入转化罐，同时投入5苄基海因。底物5苄基海因总重 量为絮凝前发酵液总重量的1/5-1/6。转化过程中5苄基海因分批投入，保持底物浓度3%。 转化罐采用氮气保护，压力为0. 1-0. 2公斤，转化温度90°C，搅拌速度120转/分钟，PH值保持在8，转化时间M小时，底物5苄基海因转化率100%。 (3)常规收集转化清液，依次经后提炼、浓缩蒸发、结晶、离心、干燥得成品，D-苯 丙氨酸的产品收率可达84 %。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用高活性生物酶合成Ｄ－苯丙氨酸的制备工艺，其特征在于采用以下步骤制成：（１）多元培养基培养Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ Ｎｏ．１菌种：ａ）一级发酵：发酵液中按重百分比计含液糖２％，玉米浆２％，氯化钠０．３％，硫酸铵０．１－０．１２％，ＰＨ值为６．７－７．０，温度３５－３７℃，培养时间２０小时；ｂ）二级发酵：发酵液中按重百分比计含液糖２％，玉米浆２％，氯化钠０．３％，硫酸铵０．１－０．１２％，硫酸镁０．０５－０．０６％，ＰＨ值为６．７－７．０，温度３５－３７℃，培养时间２０小时；ｃ）三级发酵：发酵液中按重百分比计含液糖２％，玉米浆２％，氯化钠０．３％，硫酸铵０．１－０．１２％，硫酸镁０．０５－０．０６％，氯化钴０．０１－０．０２％，诱导剂２．０％，ＰＨ值为６．７－７．０，温度３５－３７℃，培养时间１６小时；（２）絮凝收集菌丝体，将收集的菌丝体投入转化罐，同时投入５苄基海因，５苄基海因重量为絮凝前发酵液总重量的１／５－１／６；转化罐采用氮气保护，压力为０．１－０．２公斤，转化温度９０℃，搅拌速度１２０转／分钟，ＰＨ值保持在８，转化时间２４小时；（３）常规收集转化清液，经后提炼、浓缩蒸发、结晶、离心、干燥得成品。...
【技术特征摘要】
1.一种利用高活性生物酶合成D-苯丙氨酸的制备工艺，其特征在于采用以下步骤制成(1)多元培养基培养PsudomonasNo. 1菌种a)一级发酵发酵液中按重百分比计含液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0.3%，硫酸铵 0. 1-0. 12%，PH 值为 6. 7-7. 0，温度 35_37°C，培养时间 20 小时；b)二级发酵发酵液中按重百分比计含液糖2 %，玉米浆2 %，氯化钠0. 3 %，硫酸铵 0. 1-0. 12%，硫酸镁 0. 05-0. 06%，PH 值为 6. 7-7. 0，温度 35-37°C，培养时间 20 小时；c)三级发酵发酵液中按重百分比计含液糖2%，玉米浆2%，氯化钠0.3%，硫酸铵 0. 1-0. 12%，硫酸镁 0. 05-0. 06%，氯化钴 0. 01-0. 02%，诱导剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔传僧，
申请(专利权)人：崔传僧，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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