鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及其化学发光分析新方法。其一是鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针，该分析探针是由鲁米诺直接键合的纳米金标记的核酸所组成。其中，鲁米诺直接键合的纳米金是由鲁米诺一步还原氯金酸得到的。其二是基于该鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针的化学发光分析方法。其三是实施该分析方法的试剂盒。本发明专利技术的基于核酸分析探针的化学发光分析方法具有灵敏度高（如测定特定序列的单链ＤＮＡ检测限可达１．９×１０－１６ｍｏｌ／Ｌ）、线性范围宽、重现性好、操作简单、成本低廉等优点，可用于各种样品中的ＤＮＡ、ＲＮＡ、适配体对应配体的测定。在临床诊断与治疗、药物分析、食品安全检测、环境监测等领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针及利用该分析探针进行化学 发光分析的方法。
技术介绍
化学发光分析是根椐化学反应中所产生的辐射光强度，确定待测物含量的分析 方法。由于其灵敏度高、线性范围宽，且仪器简单、操作方便、分析快速，已经成为 金属离子、小分子有机物、氨基酸、蛋白质和核酸等多种物质分析中极为有力的工具。 其中利用化学发光分析，以核酸和标记物形成分析探针来对特定物质进行检测的分析方 法发展迅速，是近年来化学发光分析方法研究的热点之一(Li，T. ； Li, B.L. ； Dong, SJ.Anal.Bioanal.Chem.2007，389，887 ； Wang, X.Y. ； Zhou, J.M. ； Yun, W. ； Fang, Y.Z.Anal.Chim.Acta.2007, 598，242 ； Li, H.G. ； He, Z.K.Analyst 2009，134，800 ； Wang, Χ.Y. ； Yun, W. ； Dong, P. ； Zhou, J.Μ. ； He，P.G. ； Fang, Y.Z.Langmuir 2008，24，2200 ； Miao，J R. ； Cao, Z.J. ； Zhou, Y. ； Lau, C.W. ； Lu J.Z.Anal. Chem.2008, 80，1606)。核酸探针是一段有特定序列、具有一定长度(15-近千个核苷酸)的、带有合适 标记物、对靶分子有特异性识别能力的单链核酸片段，通常以研究和临床诊断与治疗为 目的，用来检测特定序列DNA、RNA或适配体对应的配体。核酸探针按其功能不同， 分为DNA探针、RNA探针、适配体探针。DNA探针或RNA探针主要是指一段DNA 或RNA单链分子，利用DNA或RNA杂交技术对与探针链互补的DNA或RNA进行检测 (Zhang, J. ； Qi, H.L. ； Li, Y. ； Yang, J. ； Gao, Q. ； Zhang, C.X.Anal.Chem.2008, 80，2888 ； Cissell, Κ Α. ； Rahimi, Y. ； Shrestha, S. ； Hunt, E.A. ； Deo, S.K.Anal. Chem.2008, 80，2319)。适配体探针是通过指数富集系统进化技术体外筛选得到的能与 靶分子高亲和、高特异性结合的核酸分子，是一段短的单链寡核苷酸序列，即单链DNA 或RNA分子。适配体与靶分子之间分子识别功能与抗原抗体作用极为相似，其可检测 靶分子范围很广，如金属离子、有机物、氨基酸、肽、核酸、蛋白质、细胞等(Jones， L A. ； Clancy, L.E. ； Rawlinson, W.D.Antimicrob.Agents.Chemother.2006, 50, 30)。由于核酸不具有高灵敏检测的固有物理化学特性，因此许多基于核酸探针的分 析需要标记技术。标记技术的原理是采用具有特殊物理化学性质的标记物与特定序列的 核酸片段进行偶联，通过对标记物的测定达到对目标分析物进行测定的目的。由于核酸 分析技术主要利用碱基配对或适配体特异性识别形成的核酸双链或适配体复合物的高度 稳定性，在此基础上构建夹心方法进行检测，其分析灵敏度取决于所采用的标记物，因 此制备由核酸和标记物构成的、特异、灵敏的核酸分析探针是这一技术成功的关键。在 基于核酸分析探针的化学发光分析中，常用的标记物有(1)参与化学发光反应的分子 或离子标记物，包括吖啶酯衍生物、联吡啶钌衍生物、异鲁米诺及其衍生物。采用此类 标记物一般首先需要用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)对标记物进行活化，即EDC-NHS反应，然后再与分析探针所用的核酸 进行缩合反应(Li，Y. ； Qi, H.L. ； Peng, Y.G. ； Zhang, C.X.Electro.Commu.2007, 9，2571)。由于缩合反应过程复杂且需对反应后产物进行纯化分离，导致了较高的分析成 本。(2)酶类，如DNA酶、碱性磷酸酯酶和过氧化物酶、地高辛等，大都利用酶对特定 化学发光反应的催化作用，但由于酶的化学修饰对其反应活性有所影响，因而存在容易 失活，分析稳定性不佳的问题。随着纳米生物技术的发展，纳米标记物已经受到了人们的关注。由于纳米粒子 稳定性好、易于制备、表面积大、吸附量高、生物相容性好，是一种很有前途的新兴的 标记物。金属纳米粒子如纳米金、纳米银等已经作为标记物被用于核酸分析探针，显示 出了较好的效果。2008年，Lu研究小组建立了以纳米金为标记物的特定序列DNA的化 学发光分析方法(Fan，Α Ρ. ； Lau, C.W. ； Lu, J.Z.Analyst 2008，133，219)，其原理是 以磁性微珠为反应平台，先将捕获探针连接于磁微珠，经杂交反应使目标DNA偶联于捕 获探针后，再将标记有纳米金的分析探针DNA结合于目标DNA，再采用“溶出法”， 将纳米金氧化溶解为三价金离子Au(III)，然后利用Au(III)对鲁米诺化学发光体系的催 化或氧化作用进行检测，其检测限为lpmol/L。这种方法的主要缺陷在于溶解氧化纳米 金需要十分苛刻的实验条件，如高浓度的HNO3-HCl,或者有毒的HBr-Br2,导致较高 的背景化学发光。同样采用溶出法检测的还有Zhang等人(Zhang，S.S. ； Zhong, H.； Ding, C.F. ； Anal.Chem.2008, 80，7206)所报道的用纳米金和CuS纳米粒子分别标记单 链DNA的两个端基作为分析探针，该方法是在金片上固载捕获探针后，再与目标DNA 和分析探针形成“夹心式” DNA复合物，采用“溶出法”将纳米CuS溶解为Cu(II)， 用Mmin0I-H2O2-Cu2+体系测定了特定序列的目标DNA。这种方法虽然灵敏度较高，线 性范围下限为10_14mol/L，但实验中采用两种纳米粒子对核酸进行标记，需采用双基团修 饰的DNA探针，增加了分析成本；两种纳米粒子需分步标记，非常耗时且步骤复杂；同 时“溶出法”实验条件苛刻，需要高浓度强酸，限制了该方法在实际分析中的应用。而 Wang 等人(Wang，H. ； Zhang, C.X. ； Li, Y. ； Qi, H.L.Anal.Chim.Acta 2006，575， 205)应用纳米金胶作为标记有Ru[ (bpy) 2NHS]的单链DNA探针的载体，对靶单链DNA 进行了杂交分析，因为纳米金胶体在一定程度上提高了杂交效率，使得修饰电极的电致 化学发光信号得到了放大，最终对靶ssDNA的检测限为5.0Xl(T12mol/L。此分析方法虽 然避免了 “溶出法”，但也需采用EDC-NHS反应，且需要对分析探针进行纳米金标记 和发光分子标记的双步骤标记，因此存在操作复杂、步骤繁多、需多次进行分离、成本 高昂的缺陷。因此，发展新型的高灵敏度、简单、价廉的核酸分析探针具有重要意义。鲁米诺(luminol)，又名发光氨。化学名称为3_氨基邻苯二甲酰胼，化学式为 C8H7N3O2。常温下是一种黄色晶体或者米黄色粉末，是一种比较稳定的人工合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分析探针，是由鲁米诺直接键合的纳米金标记核酸分子形成的。

【技术特征摘要】
1.一种核酸分析探针，是由鲁米诺直接键合的纳米金标记核酸分子形成的。2.根据权利要求1所述的核酸分析探针，其特征在于，所述鲁米诺直接键合的纳米金 是利用鲁米诺还原氯金酸得到的。3.根据权利要求1或2所述的核酸分析探针，其特征在于，所述核酸分子为DNA、 RNA或适配体分子。4.根据权利要求1-3中任一所述的核酸分析探针，其特征在于，所述标记的方法为下 述1)或2)的方法 1)将所述核酸分子端基修饰生物素，然后通过链霉亲和素与所述鲁米诺直接键合的 纳米金连接；2)将所述核酸分子端基修饰巯基，然后与所述鲁米诺直接键合的纳米金连接。5.根据权利要求1-4任意一项所述的核酸分析探针，其特征在于，所述核酸分析探针 的制备包括以下步骤(1)用鲁米诺还原氯金酸合成鲁米诺直接键合的纳米金；(2)孵育鲁米诺直接键合的纳米金与链霉亲和素，得到连接链霉亲和素的鲁米诺直接 键合的纳米金；(3)孵育连接链霉亲和素的鲁米诺直接键合的纳米金与端基修饰有生物素的核酸分 子，得到鲁米诺直接键合的纳米金核酸分析探针。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的核酸分析探针，其特征在于，所述核酸分析探 针为化学发光核酸分析探针。7.根据权利要求6所述的核酸分析探针，其特征在于，所述化学发光核酸分析探针为 电致化学发光核酸分析探针。8.一种基于权利要求1-7的核酸分析探针的化学发光分析方法，包括如下步骤A、合成如权利要求1-7任一项所述的核酸分析探针；B、在固相载体上组装具有连接功能的修饰层，形成修饰层/固相载体；C、孵育捕获探针与步骤B得到的修饰层/固相载体，使捕获探针连接到修饰层/固 相载体上，形成捕获探针/修饰层/固相载体复合物；D、孵育目标分析物与步骤C所得到的捕获探针/修饰层/固相载体复合物，使捕获 探针/修饰层/固相载体复合物与目标分析物结合，形成目标分析物/捕获探针/修饰层 /固相载体复合物；E、孵育步骤D所得到的目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体复合物与步骤A 所得到的核酸分析探针，形成核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体 夹心式核酸复合物；F、将步骤E所得到的核酸分析探针/目标分析物/捕获探针/修饰层/固相载体夹 心式核酸复合物放入化学发光池中，加入底液，产生化学发光，用发光仪进行检测。9.根据权利要求8所述的化学发光分析方法，其特征在于，所述的捕获探针为端基修 饰有基团的核酸分子；所述核酸分子为DNA、RNA或适配体分子。10.根据权利要求9所述的化学发光分析方法，其特征在于，所述基团为生物素或巯 基；本发明优选为生物素。11.根据权利要求8-10中任一所述的化学发光分析方法，其特征在于，所述固相载体为电极、磁微珠、微孔板、尼龙或玻璃；所述修饰层由下述1)和2)的物质组成1) 具有连接功能的桥连分子或具有连接功能的桥连基团；2)连接有链霉亲和素的纳米金； 所述连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连分子或所述桥连基团连接到所述固相载体 上。12.根据权利要求8-11中任一所述的化学发光分析方法，其特征在于，所述步骤B中 在固相载体上组装具有连接功能的修饰层的方法为下述a)或b)a).所述固相载体为电极，所述修饰层中的连接有链霉亲和素的纳米金通过所述桥连 分子连接到所述电极上；所述电极为金电极时，所述桥连分子为双巯基化合物或同时具 有氨基和巯基的化合物，所述双巯基化合物优选为1，3'-丙二硫醇；所述电极为氧化 铟锡电极时，所述桥连分子为3-巯丙基_三甲氧基硅烷；b).所述固相载体为磁微珠或尼龙，所述修饰层中连接有链霉亲和素的纳米金通过所 述桥连基团连接到氨基化磁微珠或尼龙上，所述桥连基团为氨基；所述固相...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔华，柴颖，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]