含有核酸的复合物制剂的制备方法技术

一种制备高质量的、均一的含核酸复合物的制剂的方法，该制剂能进行过滤除菌，该制剂的特征是不含被认为对人体不安全的７微米或更大的粗颗粒。含有阳离子载体与核酸聚合物的复合物的该制剂的制备方法，其特征在于，在阳离子载体或形成阳离子载体的材料中分别加入处于单链状态的、能至少部分形成双链的两个单链核酸聚合物，并对所有组分进行分散处理。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及含有阳离子载体和核酸聚合物的复合物制剂。该复合物有时称为脂质复合物(lipoplex)。本文所用的术语“阳离子载体”指在水中有阳性电荷、能有效输送药物(尤其是将阴离子药物输送入细胞)的药物载体。最近已深入研究了以阳离子载体作为药物载体将基因和RNA(如聚I∶C)输送入细胞。“核酸聚合物”指天然存在的或合成或半合成的多核苷酸(DNA,RNA)，以及天然存在的、合成的或半合成的寡核苷酸。
技术介绍
含有阳离子载体与具有双螺旋结构的聚阴离子双链核酸聚合物的复合物的含核酸复合物制剂只能通过将阳离子载体与双链核酸聚合物混合来制备。然而，在用该方法制得的含核酸复合物制剂中，其颗粒通常较粗，直径为数微米至数百微粒，而且不均一。具有这些粗大的不均一颗粒的含核酸复合物制剂有这样的缺点，即，在关于核酸聚合物向胞内转移和信号表达方面没有充分地获得均一的数据。关于颗粒粗大的最关键问题是，很难在工业规模上进行灭菌，而且在静脉内给药的情况下，尽管药剂是根据其安全给予人用的前提来制备的，但是在注射针或毛细血管内可能会发生栓塞等现象。这些问题很难用上述单单通过混合来制备复合物制剂的方法解决，而且也很难通过采用合适的乳化分散装置的分散方法来解决。为使复合物制剂稳定化进行冷冻干燥而导致颗粒沉淀也是一个问题。为了减少给药量，在给药时减轻患者和医护人员的负担，并且为了获得复合物制剂的生产效率，希望复合物制剂中的核酸聚合物有高的浓度。然而，在用传统方法时，当核酸聚合物的总量为0.1毫克/毫升或更高，尤其是0.5毫克/毫升或更高时，在生产过程中发生显著的凝集，产生了肉眼易确认的大的沉淀或悬浮固体。这些不能用任何分散方法来充分地分散。从生理特性和对各种核酸酶的稳定性出发，传统地根据常识采用具有双螺旋结构的双链的基因和RNA(如聚I∶C)。例如，已经知道，通过分开给予聚I和聚C来代替具有生理活性(如强的干扰素诱导作用和免疫增强作用等)的聚I∶C没有获得足够的药理效果(Archives of Virology,51,199-215(1976))。因此，已认为具有双螺旋结构的双链是基因以及诸如聚I∶C的RNA所必需的。对于含有阳离子载体与核酸聚合物的复合物的含核酸复合物制剂，没有讨论双螺旋结构的必要性，且在复合物制剂的生产过程中通常采用具有双螺旋结构的双链DNA和双链RNA。本申请人已经提交了作为癌细胞系中核酸酶激活制剂的含核酸复合物制剂的专利申请，含核酸复合物制剂由阳离子载体和诸如聚I∶C的双链RNA组成，因为它激活了癌细胞中的核酸酶，从而有效地治疗癌症；本申请人还提交了含有核酸复合物制剂作为肝炎治疗剂的申请，因为它们能长时间地诱导出对肝脏和脾脏特异的有效量的干扰素(PCT/JP98/04695,PCT/JP99/01438)。专利技术揭示本专利技术的目的具体是提供一种制备高质量的均一的含核酸复合物制剂的方法，该制剂的特征是能进行所谓的过滤除菌，且该制剂不含被认为对人体安全有害的7微米或更大的粗颗粒。本专利技术者首次发现，在含有阳离子载体以及核酸聚合物的复合物的含核酸复合物制剂的制备过程中，通过使用从双螺旋结构分离出的或最初未形成双链结构的具有单链的核酸聚合物，而不使用通常具有双螺旋结构的双链DNA或双链RNA，可以一举解决上述问题而不会影响其药理活性，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术可包括一种制备含核酸复合物制剂的方法，该方法的特征在于，在所述含有阳离子载体和核酸聚合物的复合物的含核酸复合物制剂(后文称为“含核酸复合物制剂”)的制备过程中，在阳离子载体或能形成阳离子载体的原料中，分开加入两个单链形式的、至少能部分形成双链的单链核酸聚合物，并进行分散处理。下面将详细描述本专利技术。适用于本专利技术的“阳离子载体”包括PCT WO94/19314中公开的药物载体，如下式结构式[Ⅰ]表示的2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰-1,3-O-二油酰基甘油(后文称“化合物A”)，以及磷脂作为必要成分形成的药物载体，和诸如聚赖氨酸的药物载体，此外还有市售的Lipofectin(脂转染试剂，商品名)、Lipofectamine(脂转染胺试剂，商品名)、Lipofectace(商品名)、以及DMRIE-C(商品名)。 适用于本专利技术的“两个单链核酸聚合物”例如包括，构成天然基因或人工重组的基因(如质粒)的两个单链DNA和单链RNA，两个单链RNA如聚I和聚C、聚A和聚U、聚I和聚C12U、部分经化学修饰的聚I(如聚(7-脱氮肌苷酸))和聚C、聚I和有部分化学修饰的聚C(例如聚(5-溴胞苷酸)、聚(2-硫代胞苷酸))，但是并不局限于这些，只要它们是能至少部分形成双链的单链核酸聚合物即可。本专利技术适用于两个单链RNA，如聚I和聚C，它们构成了具有生理活性(例如强的诱导干扰素的作用)的聚I:C。本文所用的“聚I”、“聚C”、“聚A”、“聚U”和“聚C12U”分别指聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚腺苷酸、聚尿苷酸以及胞苷酸和尿苷酸的共聚物(其中大约每12个胞苷酸中有一个被尿苷酸置换)。“能至少部分形成双链”指互补的碱基处于这样的程度下，即生理条件下它们能在两个单链核酸聚合物中存在而形成双链的程度，而该程度因两个单链核酸聚合物的种类以及每个核酸聚合物的长度而异，具体地说，互补碱基的长度为20个碱基或更高。每个单链核酸聚合物所具有的碱基数合适的为10000或更小，较佳的为2000或较小，但并非特别局限于这些。碱基数可根据每个核酸聚合物所具有的特性来合适地选择。另外，两个单链核酸聚合物不必由数目相同的碱基组成。通常，每个核酸聚合物存在一个由各种数目的碱基所组成的一定的分布，但是各碱基数是指碱基数的最大分布，在本文中称为“平均碱基数”。另外，例如可根据有效性和安全性之间的平衡来确定本专利技术中聚I和聚C的平均碱基数。具体地说，合适的在30-3000碱基范围内，较佳的在60-2000碱基范围内，更佳的100-500碱基范围内。由上述化合物A和磷脂作为必要组分形成的药物载体(阳离子载体)中的磷脂没有特别的限制，只要它们是药学上可接受的。例如，它们包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂和卵磷脂。还可包括氢化的磷脂。较佳的磷脂可包括卵黄磷脂酰胆碱、卵黄卵磷脂、大豆卵磷脂和卵黄磷脂。可采用两种或多种磷脂。另外，在这些阳离子载体中，磷脂酰胆碱或卵磷脂比阳离子载体中常用的磷脂酰乙醇胺更佳。磷脂与化合物A的组分比因磷脂种类以及施加的两个单链核酸聚合物的种类等而异，然而，对于1份重量的化合物A，磷脂约为0.1至10份重量，较佳的为0.5至5份重量，更佳的为1至2份重量。当用卵磷脂作为磷脂时，该比例是类似的。核酸聚合物与阳离子载体的组分比因阳离子载体的来源种类以及所用的核酸聚合物种类等而异，然而，对于10份重量的阳离子载体，核酸聚合物的总量约为0.05至10份重量，较佳的为0.1至4份重量，更佳的为0.5至2份重量。同样，当复合物由聚I和聚C以及以化合物A和磷脂为必要组分制成的阳离子载体形成时，若两个单链核酸聚合物是聚I和聚C，则对于10份重量的阳离子载体来说，聚I和聚C的总量约为0.05至10份重量，较佳的为0.1至4份重量，更佳为0.5至2份重量。本专利技术的含核酸复合物制剂(后文称为“本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含核酸复合物制剂的制备方法，其特征在于，在含有阳离子载体与核酸聚合物的复合物的所述含核酸复合物制剂的制备过程中，在阳离子载体或能形成阳离子载体的原料中，分别加入两个单链形式的能至少部分形成双链的单链核酸聚合物，然后对混合物进行分散处理。

【技术特征摘要】
JP 1998-5-25 142763/981．一种含核酸复合物制剂的制备方法，其特征在于，在含有阳离子载体与核酸聚合物的复合物的所述含核酸复合物制剂的制备过程中，在阳离子载体或能形成阳离子载体的原料中，分别加入两个单链形式的能至少部分形成双链的单链核酸聚合物，然后对混合物进行分散处理。2．根据权利要求1所述的含核酸复合物制剂的制备方法，其中能至少部分形成双链的两个单链核酸聚合物的平均碱基数均在100至2000范围内。3．根据权利要求1或2所述的含核酸复合物制剂的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杉原胜広，关纯造，平林加寿子，
申请(专利权)人：日本新药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]