用于肺送递的稳定的浓缩胰岛素制剂制造技术

本发明专利技术公开了物理和化学稳定性高的浓缩含水胰岛素制剂。该制剂适于肺送递。通过提供其中的氯化物浓度保持在５０ｍＭ以下并且其中的其它阴离子例如磷酸根的浓度减到最少的胰岛素制剂实现了该目的。该含水胰岛素制剂含有３至２０ｍＭ人胰岛素或其类似物或衍生物，低于５０ｍＭ的氯化物，低于１０ｍＭ的除氯离子和乙酸根之外的其它阴离子，每６分子胰岛素２至５个Ｚｎ↑［２＋］离子和每６分子胰岛素至少３个酚类分子。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及物理和化学稳定性高并且适于肺送递的浓缩含水胰岛素制剂。自从20世纪20年代胰岛素问世以来，人们一直在进行研究以改善糖尿病的治疗。为了帮助避免极端的血糖水平，糖尿病患者通常接受多次注射疗法，在每次用餐时给药胰岛素。在溶液中，胰岛素的自缔合方式受蛋白质浓度、金属离子、pH值、离子强度和溶剂组成的影响。对于常用的含有U100胰岛素、锌离子、等渗剂和苯酚防腐剂的可溶性制剂，必需考虑如下平衡已知的胰岛素降解方式包括a)原纤维形成；b)在A18、A21和B3脱酰氨基；c)通过转酰氨基作用或形成Schiff-碱而形成二聚体；d)二硫化物交换反应。根据Brange的描述(《胰岛素的稳定性》(Stability of Insulin),Kluwer Academic Press,1994)，所有这些降解反应在单体的情况下要比六聚体时快得多。因此，稳定胰岛素制剂最有效的方法是使上述平衡尽可能地偏向右侧。除了该质量作用的总的影响外，选定残基的反应性还受其直接参与T→R构象转变的影响。因此，B3Asn在R-状态时(当残基在α-螺旋中时)的反应性要比T状态时低得多。二锌胰岛素六聚体的T6、T3R3和R6构象之间的相互转变受与T3R3和R6形式结合的配体的调节。阴离子如氯离子对T3R3和R6的金属离子中的第四配位位置具有亲和性，而防腐剂例如苯酚则可以与位于T3R3和R6形式表面附近的疏水性袋结合(Derewenda，《自然》(Nature)338,594,1989和Brzovic，《生物化学》(Biochemistry)33,130557,1994)。通过使用Co2+胰岛素，已经证实阴离子和苯酚结合的组合效果在稳定R6状态时是特别有效的(Brader,Trends Biochem.Sci.30,6636,1991和Bloom，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)245,324,1995)。此外，对于Zn2+-和Co2+胰岛素均已证实，苯酚比间甲酚在诱导胰岛素六聚体的R-状态时更为有效(Wollmer，《生物化学》(Biol.Chem.)Hoppe-Seyler 368,903,1987和Choi，《生物化学》(Biochemistry)32,11638,1993)。诱导R-状态的高亲和性苯酚衍生物是7-羟基-吲哚((Dodson,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 345,153,1993)、间苯二酚和2,6-及2,7-二羟基-萘((Bloom，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)245,324,1995)。胰岛素的物理变性称为原纤维形成。在原纤维状态，延伸的肽链平行或反平行地伸展并在彼此之间形成氢键，称为β-结构或β-折叠片。原纤维通常代表蛋白质的最低能量状态，只有苛刻的条件例如强碱才可以从该状态重新生成正确折叠的蛋白质的天然状态。可以增加原纤维形成速率的因素是升高温度、增加液相和气相之间的表面积，对于不含锌的胰岛素，还可以增加浓度。对于六聚的锌胰岛素，原纤维的形成速率随着浓度的增加而降低。据信可以通过胰岛素的单体化促进原纤维的形成。胰岛素的原纤维具有凝胶或沉淀状的外观。在B-链的C末端截短的胰岛素衍生物例如去五肽(B26-B30)胰岛素和去八肽(B23-B30)胰岛素比人胰岛素更倾向于形成原纤维。易于从六聚体单位解离成单体形式的胰岛素类似物例如AspB28人胰岛素和LysB28-ProB29人胰岛素，同样比人胰岛素更倾向于形成原纤维。可以通过形成稳定六聚体单位的条件来稳定胰岛素的天然状态，即存在锌离子(2-4锌/六聚体)、苯酚(0.1-0.5％w/v)和氯化钠(5-150mM)。加入可以降低气-液界面表面张力的物质可以进一步降低原纤维形成的倾向。因此，平均分子量为约1800的聚乙二醇、聚丙二醇及其共聚物可在用于输注泵的浓缩胰岛素溶液中用作稳定剂(Grau,1982:Neue Insuline(编者Petersen,SchlLiter&Kerp),FreiburgerGraphische Betriebe,411-419页和Thurow,1981专利DE2952119A1)。关于胰岛素物理稳定性的综合评论参见Brange 1994，《胰岛素的稳定性》(Stability of Insulin),Kluwer Academic Publisher,18-23页。制剂中胰岛素的化学降解大部分是由于涉及天冬酰胺残基，特别是残基B3和A21的甲酰胺功能基的反应。酰胺基团的水解生成脱酰胺基的衍生物，涉及另一个分子的氨基的转酰氨基作用导致共价连接的二聚体的形成，并在类似的连续反应后，生成三聚体或更高级的聚合物。在酸性溶液中，AsnA21是最活泼的，导致AspA21胰岛素的生成(Sundby，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)237,3406,1962)。在通过酸醇萃取得到的来自牛和猪的粗品胰岛素中，分离出的含量最多的二聚体是AspA21-GlyA1和AspA21-PheB1连接的(Helbig 1976,Insulindimere aus der B-Komponente von Insulinpraparationen,Rheinisch-Westfalischen Technischen Hochschule的论文，Aachen)。在中性溶液(该溶液是用于注射治疗的胰岛素制剂的优选方式)中，AsnB3是最易受影响的残基。降解产物包括AspB3胰岛素、AspB3-GlnB4-异肽胰岛素和其中AspB3提供羰基部分与另一个分子的氨基之间形成肽键的二聚体和更高级的聚合物。关于胰岛素化学稳定性的综合评论参见Brange 1994，《胰岛素的稳定性》(Stability ofInsulin),Kluwer Academic Publisher,23-26页。至于稳定六聚体单位的物理稳定性条件，即存在锌离子(2-4锌/六聚体)、苯酚(0.1-0.5％w/v)和氯化钠(5-150mM)，可以降低在中性pH下存放过程中降解产物的形成速率。当不采用稳定六聚体单位的条件时，可以观察到不同类型的聚合反应。因此，在不含锌、苯酚和氯化钠并采用50℃的温度时，二硫键连接的二聚体和高分子量的聚合物是主要的形成产物。形成机制是二硫化物互变反应，这是由二硫化物的β-消除引起的(Brems，《蛋白质工程》(Protein Engineering)5,519,1992)。胰岛素的稳定性受pH、金属离子浓度、离子强度、苯酚类物质、溶剂组成(多元醇、乙醇和其它溶剂)、纯度和品种(牛、猪、人、其它类似物)的影响。综述参见Brange《胰岛素的盖伦制剂》(Galenics ofInsulin),Springer-Verlag 1987,18和46页。胰岛素在接近其等电位pH的pH值下、即4.0-7.0的pH范围内溶解性很低。高浓度的猪胰岛素溶液(5000U/ml～30mM)被调至酸性pH(Galloway，《糖尿病护理》(Diabetes Care)4,366,1981)，但制剂中的胰岛素由于在AsnA21脱酰氨基化而是高度不稳定的。在中性pH下可以制备高浓度的不含锌的胰岛素溶液，但这些溶液由于高的聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含水胰岛素制剂，含有：３至２０ｍＭ人胰岛素或其类似物或衍生物，低于５０ｍＭ的氯化物，低于１０ｍＭ的除氯离子和乙酸根之外的其它阴离子，每６分子胰岛素２至５个Ｚｎ↑［２＋］离子和每６分子胰岛素至少３个酚类分子。

【技术特征摘要】
DK 1998-10-16 PA1998013271．一种含水胰岛素制剂，含有3至20mM人胰岛素或其类似物或衍生物，低于50mM的氯化物，低于10mM的除氯离子和乙酸根之外的其它阴离子，每6分子胰岛素2至5个Zn2+离子和每6分子胰岛素至少3个酚类分子。2．权利要求1的胰岛素制剂，含有3至15mM人胰岛素或其类似物或衍生物，优选约3mM、约6mM、约9mM、约12mM或约15mM人胰岛素或其类似物或衍生物。3．权利要求2的胰岛素制剂，含有4至15mM，优选5至15mM，更优选6至15mM人胰岛素或其类似物或衍生物。4．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，含有至多50mM酚类分子，优选每6分子胰岛素3至12个酚类分子，更优选每6分子胰岛素3至9个酚类分子。5．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，含有低于40mM，优选低于30mM的氯化物，更优选含有5至20mM氯化物。6．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，含有至多5mM磷酸盐。7．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，含有每6分子胰岛素2至4个Zn2+离子，优选2.2至3.2个Zn2+离子。8．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，还含有5至150mM两性离子胺，优选N-甘氨酰甘氨酸或甘氨酸。9．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，还含有5至50mM三羟基甲基氨基甲烷。10．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，含有钠离子、钾离子或其混合物作为阳离子。11．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，还含有0.001％(重量)至1％(重量)的非离子表面活性剂，优选吐温20或Polox 188。12．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，还含有1mM至10mM的阴离子表面活性剂，优选牛磺胆酸钠。13．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，含有人胰岛素。14．前述权利要求任意一项所述的胰岛素制剂，含有人胰岛素类似物，其中位置B28是Asp、Lys、Leu、...

【专利技术属性】
技术研发人员：S海弗仑德，
申请(专利权)人：诺沃挪第克公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]