Aβ肽的组合物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及通过调节ｐＨ值起到增溶作用，进而有效灭菌，所获得的含有溶解的、或混悬的Ａβ肽组合物；本发明专利技术还涉及该组合物的制备方法，以及用所获组合物治疗和预防阿耳茨海默氏病症。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术主要涉及包含引起哺乳动物抗体反应方面非常有用的蛋白质的药物组合物。更特别地，本专利技术涉及包含有效量的能引起哺乳动物免疫反应的淀粉样β肽和药用稀释剂组成的药用组合物。该稀释剂优选为无菌的可注射用水相。与本专利技术相关的
技术介绍
淀粉样β肽，也称为A-β或Aβ肽，是淀粉样前体蛋白(APP)的剪切产物。它是哺乳动物脑内淀粉样斑的主要组成成分，而淀粉样斑常见于阿耳茨海默氏病症，并且是此病的一大特点。由于蛋白酶对APP作用的多样性，Aβ肽是一个长度可变的、含39-43氨基酸的肽链。APP蛋白的一些突变和阿耳茨海默氏病的出现相关。例如，Goate等《自然》(Nature)349，704(1991)(缬氨酸717突变成异亮氨酸(valine717to isoleucine))；Chartier Harlan等《自然》(Nature)353，844(1991)(缬氨酸717突变成甘氨酸(valine717to glycine))；Murrell等《科学》(Science)254，97(1991)(缬氨酸717突变成苯丙氨酸(valine717to phenylalanine))；Mullan等，《自然遗传学》(Nature Genet.)1，345(1992)(双突变使赖氨酸595、天冬氨酸596突变成甲硫氨酸595、亮氨酸596(a double mutation changinglyisne595-methionine596to asparagines595-leucine596))。通常认为，这些突变通过增强或改变从APP到Aβ肽的加工过程引起阿耳茨海默氏病，特别是APP的加工引起Aβ42和Aβ43数量上的增加。其他基因的突变，如早老基因PS1和PS2，被认为是间接影响APP的加工过程而增加Aβ42和Aβ43的量(Hardy，TINS20，154(1997)。观察结果显示Aβ肽，特别是Aβ42是阿耳茨海默氏病的致病因素。在大脑内，Aβ肽凝聚而形成淀粉样沉淀，包括多肽通过β折叠结构组成原纤维。最近关于治疗或预防阿耳茨海默氏病的治疗性研究的推动力，集中在阻止或减慢大脑内Aβ肽的生成，或者阻止它的后释放过程，或者阻止沉淀形成淀粉样斑。本专利技术应用的特别重要的一个治疗途径，是应用Aβ肽引起机体的免疫反应来抵消它的作用。例如，PCT公开文本No.WO99/27944，结合在此作为参考。本专利技术涉及一种新颖和出乎意料的方法，用来实现PCT公开文本No.WO99/27944所披露的专利技术。特别地，本专利技术包括将Aβ肽的长链形式的特定制剂给病人用药，以引起免疫反应。然而，在现有技术中，Aβ肽的长链形式很难溶解于常规的制剂系统。特别的，Hilbich等《分子生物学杂志》(J. Mol.Biol.)，218(1)，pP.149-64，报道尽管Aβ1-43肽在纯水中一定程度上是可溶的，但加入离子成分，如缓冲液、或盐类、或者有机溶剂，可引起肽以非晶体聚集物的形式从溶液中沉淀出来。例如，Hilbich发现磷酸盐缓冲液(“PBS”，在本例子中为含有135mM的NaCl、3mM的KCl、8mM的Na2HPO4·H2O、和2mM的KH2PO4，pH为7.5)，其使该组合物中90-94％的肽不可溶。PBS是常用的注射用组合物的载体，它和生命系统中的离子浓度和pH水平相似。5mM NaCl可引起42-50％肽类的沉淀。(引述文献同前，p.153，Table2)。纯水中的肽溶液是低渗的，这些溶液的pH值被Hilbich(同一作者)确定为5.5。通常，人血液的pH是7.4左右。Dyrks等报道Aβ肽在生理条件下是不溶的。Dyrks，T.，Weidemann，A.，Multhaup，G等，《欧洲分子生物学杂志》(EMBOJ)7，p.949-57(1988)。Aβ肽在溶液中的构象可以用圆二色法(C.D.)测定。Hilbich等(同前作者)报道了用圆二色法对Aβ肽和片段的构象的研究。另外，M.Manning的论著《通过圆二色法测定蛋白的结构和可溶性》(Protein Structure and Stability Assessment by Circular DichrosimSpectroscopy)，讲述了生物酶的稳定性和特异性研究。Himmel，M.E.和Georgiou，G.，ACS Symposium Series 516(1993)P.36。这里所引述的，以及Manning所引述的文献在此列为参考文献。Kline等，美国专利No.5,851,996(‘996专利)和No.5,753,624(‘624专利)，描述了非常少量(10-2mg或更少)的Aβ肽或片段的用药，用液体或者固体载体舌下含服，如以苯基盐溶液作载体。‘996专利指出，Aβ肽存在各种结构形式(col.2，line 13)，可以用来治疗阿耳茨海默氏病。该专利没有具体定义各种结构形式的含义，除了实施例中所用的28种氨基酸片段以外，也没有具体说明其特点。‘996专利指出的Aβ肽剂量的范围是10-10到10-2mg(第8卷，第442-43页)。从上述的观点来看，现有技术已经证明了在溶解和保持Aβ肽溶解方面的困难性。而且，长链形式的Aβ肽的低溶解性造成难于实现对其进行标准化灭菌。大部分的标准灭菌方法与肽类药剂不相容，如辐射、高压灭菌、和化学灭菌技术(如用环氧乙烷和戊二醛)，上述方法可引起肽的降解。因此，可选择肽的过滤进行Aβ肽灭菌。但是，Aβ肽的不溶性会引起滤膜堵塞，阻止足量Aβ肽的回收和商业生产。本专利技术目的本专利技术涉及一个惊人的和出乎预料的发现，即可以通过调节水溶液酸/碱度，达到适于溶解Aβ肽的pH值范围，以制备高浓度的Aβ肽水溶液。较好的pH值范围是约8.5-12，优选为约9-10。本专利技术进一步发现，Aβ肽的可溶性溶液通过一个合适的微孔滤纸灭菌，在过滤灭菌后可至少回收50％的Aβ肽。较好的条件下，至少70％过滤除菌的Aβ肽得到回收，优选为90％。该无菌溶液可以制成含有足量Aβ肽的药用组合物，对哺乳动物给药可引起免疫反应。优选地，可采用悬浮组合物进行非经肠给药。因此，在该组合物专利技术的一个方面，于灭菌过滤后，将该组合物的pH值调节到生理适宜条件，以形成一种至少含有0.1mg/mlAβ肽的悬浮液。该组合物可用来进行非经肠给药。该悬液组合物的pH约在5-7之间，优选为5.5-6.5。一种更优选的组合物包含足量的QS-21与Aβ肽共同组成一种看上去清澈的无菌混悬液。本专利技术进一步的发现是，可以用冻干法处理可溶无菌的Aβ肽溶液，提供包含Aβ肽的冻干制剂。可以在适宜的时间对这些组合物进行重建，以提供包含Aβ肽的水剂。该组合物的另一方面，本专利技术涉及含有至少0.01mg/ml Aβ肽的水溶液，其中该水溶液保持适宜该Aβ肽溶解的pH值。优选地，在使用有效量的药用缓冲液后，该溶液可以保持适宜的pH值。该组合物的再一方面，本专利技术涉及包含至少0.01mg/ml Aβ肽的无菌水溶液，其中该水溶液保持适宜Aβ肽溶解的pH值。优选地，在使用有效量的药用缓冲液后，该溶液可以保持适宜的pH值。另一方面，本专利技术涉及对组合物冻干处理，该冻干组合物包含Aβ肽，用下列步骤制备a)将包含至少0.01mg/ml Aβ肽的无菌水溶液冷冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有浓度至少为０．０１ｍｇ／ｍｌ的Ａβ肽水溶液的组合物，其中所述的水溶液维持使所述Ａβ肽充分溶解的ｐＨ值。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 1999-6-1 60/137,0471.一种含有浓度至少为0.01mg/ml的Aβ肽水溶液的组合物，其中所述的水溶液维持使所述Aβ肽充分溶解的pH值。2.根据权利要求1所述的组合物，其中是通过在所述的溶液中加入有效量的药用缓冲剂以维持合适的pH值。3.一种含有浓度至少为0.01mg/ml的Aβ肽的除菌的水溶液的组合物，其中所述的水溶液维持一定pH值以足够溶解所述的Aβ肽。4.根据权利要求3所述的组合物，其中是通过在所述的溶液中加入有效量的药用缓冲剂以其维持所述的pH值。5.根据权利要求1或3所述的组合物，其中所述的Aβ肽是Aβ肽的长链形式。6.根据权利要求1或3所述的组合物，其中所述的Aβ肽是Aβ42。7.根据权利要求1或3所述的组合物，其中所述的pH值范围大约为8.5到12。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述的pH值范围大约为9到10。9.根据权利要求2或4所述的组合物，其中所述的药用缓冲剂选自氨基酸、盐类、及其衍生物，可药用的碱化剂、碱金属氢氧化物、以及氢氧化铵，有机或无机酸及其盐类，及以上所述物质的混合物。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述的药用缓冲剂为甘氨酸(甘氨酸钠)、或精氨酸(盐酸精氨酸)。11.一种用以下步骤制备的Aβ肽的冻干组合物a)冷冻一种浓度至少为0.01mg/ml的Aβ肽的除菌水溶液，其中所述的水溶液保持一定的pH值以使所述的Aβ肽溶解；以及b)将上述a)步骤制备的所述冷冻组合物进行冻干。12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述Aβ肽是Aβ肽的长链形式。13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述的Aβ肽是Aβ42。14.根据权利要求11所述的组合物，其中在所述的溶液中加入有效量的药用缓冲剂，以维持所述的pH值。15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述的药用缓冲剂选自氨基酸、盐、及其衍生物；药用碱化剂，碱金属氢氧化物、及氢氧化铵，有机或无机酸、及其盐；及以上所述物质的混合物。16.根据权利要求1、3、或11所述的组合物，其中所述的Aβ肽基本上处于无规卷曲状态。17.根据权利要求1、3、或11所述的组合物，其中所述的Aβ肽的浓度大约为0.05mg/ml到2.0mg/ml。18.根据权利要求1、3、或11所述的组合物，其中所述的组合物中进一步含有药用辅剂。19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述的辅剂选自弗氏非完全辅剂、MPL、QS-21、以及明矾。20.一种包含pH值大约为5到7，浓度至少为0.1mg/ml的Aβ肽的除菌混悬液的组合物。21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述肽的混悬液中也含有有效量的药用缓冲剂。22.根据权利要求20或21所述的组合物，其中所述的Aβ肽是Aβ肽的长链形式。23.根据权利要求20或21所述的组合物，其中所述的Aβ肽是Aβ42。24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述药用缓冲剂选自氨基酸、盐、及其衍生物；药用碱化剂、碱金属氢氧化物、及氢氧化铵、有机或无机酸、及其盐；及以上所述物质的混合物。25.根据权利要求20所述的组合物，含有浓度大约为0.1到0.8mg/ml的Aβ肽、10mM的甘氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：帕米拉赫哲尔，奈纳帕特尔，
申请(专利权)人：神经实验室公司，
类型：发明
国别省市：BM[百慕大]