双齿肽结合物制造技术

本发明专利技术涉及一种特异性地与靶结合的双齿肽结合物及其制造方法，上述靶包含：（ａ）形成链间非共价键的平行、反平行或平行和反平行氨基酸链的结构稳定化区；以及（ｂ）结合至上述结构稳定化区的两个末端，并包含随机选择的各ｎ及ｍ个氨基酸的靶结合区Ｉ及靶结合区ＩＩ。本发明专利技术的双齿肽结合物表现出极低水平（例如ｎＭ水平）的ＫＤ值（解离常数），对靶表现出十分高的亲和力。本发明专利技术的双齿肽结合物不仅具有医药用途，还能用于体内分子成像、体外细胞成像以及药物传递用靶向，并且用作保护分子也非常有效。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双齿肽结合物
本专利技术涉及一种双齿肽结合物(Bipodalpeptidebinder)及其制造方法。
技术介绍
抗体是作为B细胞所产生的一种血浆蛋白质的免疫球蛋白，其特异性地识别从外部引进的抗原的特定区而结合，从而对抗原进行钝化或中和。通过应用这种抗原-抗体反应的特异性和高度的亲和力及能够区别数千万种类的抗原的抗体的多样性，当今出现了包含诊断剂和治疗剂等的多种抗体产品。目前FDA认证了21种单克隆抗体，如利妥昔单抗(Rituximab)及赫赛汀(Herceptin)的抗体在其他治疗中完全未起到效应的50％以上的患者身上产生了效果，实际上在许多研究过程中利用单克隆抗体在淋巴瘤、大肠癌或乳腺癌等方面呈现成功的临床治疗。预计治疗用抗体的整体市场规模将从2004年100亿美元增加到2010年的300亿美元呈现年均20％的成长率，并预计其市场规模将会急剧增加。踊跃开展利用抗体的新药开发的理由在于：药品的开发期间短，投资费用少，能够容易预测到副作用。并且，抗体作为生药几乎不给人体带来影响，并且抗体在体内的半衰期相当长，其期间相比低分子量药品具有压倒性的优势，因而对患者无害。单克隆抗体尽管具有这种有用性，但是在人体内被识别为外源性抗原而会引起严重的变态反应或超敏反应。并且，临床上使用这种抗癌功能的单克隆抗体时，由于生产成本高，因而具有作为治疗剂的价格急剧上涨的缺点，并且由于培养抗体的方法及纯化方法等广泛领域的技术受到各种知识产权的保护，要支付昂贵的专利权使用费。因此，为了解决此问题，以美国为中心，欧洲联盟处于抗体替代蛋白质开发的萌发期。抗体替代蛋白质作为如抗体一样具有不变区和可变区的重组蛋白质，将大小较小而稳定的蛋白质的规定部分替换成随机序列的氨基酸而构成文库(library)，将其针对靶物质进行淘选而能够找出具有较高的亲和力和优良的特异性的物质。例如报告了抗体替代蛋白质中的高亲合性多聚体(avimer)和亲和体(affibody)对于靶物质具有皮摩尔(picomole)程度的亲和力的例子。报告称这种抗体替代蛋白质由于大小较小而稳定，能够渗透到癌细胞深处，一般很少引起免疫反应。并且，尤其是能够摆脱广泛的抗体专利问题，并且在细菌中能够容易地进行大量纯化，使得生产成本降低，因此经济上相比抗体具有更大的优点。目前开发出的抗体替代蛋白质有40种，其中，在风险投资公司或跨国制药公司正试图商用化的抗体替代蛋白质正在利用纤维连接蛋白III型结构域、脂笼蛋白、LDLR-A结构域、结晶体、蛋白A、锚蛋白重复序列(Ankyrinrepeat)以及BPTI这些蛋白质，对于靶具有皮摩尔到数纳摩尔程度的亲和力。其中，艾得奈可汀(Adnectin)、高亲合性多聚体、库尼茨(Kunitz)结构域目前正处于FDA临床实验阶段。本专利技术聚焦于与迄今的利用蛋白质的抗体替代蛋白质不同的基于肽的抗体替代蛋白质。肽相比抗体能够实现适当的药物动力学、大量生产率、低毒性、抗原性抑制以及低生产成本等，因而目前替代抗体治疗剂以多种形态应用。作为治疗用药物的肽的优点在于：生产成本低，安全性及反应性高，专利税相对低廉，不太露出在不期望的免疫系统，能够抑制对于肽自身的抗体产生，容易而准确地进行通过合成的变形。但是，由于大部分的肽相比抗体，对于特定蛋白质靶呈现低的亲和力及特异性，因而具有无法使用于多种应用领域的缺点。因此，本领域中便开始涌现出关于能够克服肽的缺点的基于新颖肽的抗体替代蛋白质开发的需求。为此，本专利技术人们致力于开发出能够以高的亲和性与生物学靶分子特异性地结合的肽物质。预计这将成为能够利用对于目前许多的靶进行了报告的具有低亲和力的肽来短时间内制造具有高亲和性及特异性的新药候补物质的技术。本说明书遍及其所有内容参照并引用了多个论文及专利文献。所引用的论文及专利文献的所有揭示内容作为参照内容编入本说明书中，由此更加明确地说明本专利技术所属
的水平及本专利技术的内容。
技术实现思路
本专利技术人致力于开发出能够以十分高的亲和性(affinity)与生物学靶分子特异性地结合的肽物质。其结果表明，如果在具有比较坚固(rigid)肽骨架的结构稳定化区的两个末端随机(random)地结合肽，并将所述两个肽共同结合至靶分子，则能够获得具有大大增大的结合能力及特异性的双齿肽结合物，由此完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的在于，提供一种双齿肽结合物(bipodal-peptidebinder)的制造方法。本专利技术的另一目的在于，提供一种与生物学靶分子结合的双齿肽结合物。本专利技术的又一目的在于，提供一种对双齿肽结合物进行编码的核酸分子。本专利技术的再一目的在于，提供一种双齿肽结合物的表达用载体。本专利技术的还一目的在于，提供一种包含双齿肽结合物的表达用载体的转化体。本专利技术的其他目的及优点，将通过本专利技术的详细说明、权利要求书及附图更为明确。根据本专利技术的一实施方式，本专利技术提供一种与生物学靶分子结合的双齿肽结合物(bipodal-peptidebinder)的制造方法，该方法包含如下步骤：(a)提供双齿肽结合物的文库的步骤，上述双齿肽结合物包含：(i)结构稳定化区(structurestabilizingregion)，其包含形成有链间(interstrand)非共价键的平行线(parallel)、反平行线(antiparallel)或平行(parallel)和反平行(antiparallel)氨基酸链，以及(ii)靶结合区I(targetbindingregionI)及靶结合区II(targetbindingregionII)，与上述结构稳定化区的两个末端结合，并包含随机选择的各n及m个氨基酸；(b)使上述文库和靶接触的步骤；以及(c)选择与上述靶结合的双齿肽结合物。根据本专利技术的其他实施方式，本专利技术提供一种特异性地与靶结合的双齿肽结合物，该双齿肽结合物包含：(a)结构稳定化区(structurestabilizingregion)，其包含形成有链间(interstrand)非共价键的平行线(parallel)、反平行线(antiparallel)或平行(parallel)和反平行(antiparallel)氨基酸链；以及(b)靶结合区I(targetbindingregionI)及靶结合区II(targetbindingregionII)，其与上述结构稳定化区的两个末端结合，并包含随机选择的各n及m个氨基酸。本专利技术人等致力于开发出能够以十分高的亲和性(affinity)与生物学靶分子特异性地结合的肽物质。其结果表明，如果在具有比较坚固(rigid)肽骨架的结构稳定化区的两个末端随机(random)地结合肽，并将所述两个肽共同结合至靶分子，则能够获得具有大大增大的结合能力及特异性的双齿肽结合物。本专利技术的基本策略在于，在坚固的肽骨架的两个末端连接与靶结合的肽。此时，坚固的肽骨架起着对双齿肽结合物的整体结构进行稳定化的作用，并加强靶结合区I及靶结合区II与靶分子结合。本专利技术中能利用的结构稳定化区包含平行线、反平行线或平行和反平行氨基酸键，并包含将形成基于链间(interstrand)氢键、基于静电相互作用、疏水性相互作用、范德瓦尔斯相互作用、π-π相互作用、阳离子-π相互作用或它们的组合的非共价键本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种与靶结合的双齿肽结合物的制造方法，其特征在于，包含如下步骤：（ａ）提供一种双齿肽结合物的文库的步骤，上述双齿肽结合物包含：（ｉ）结构稳定化区，其包含形成有链间非共价键的平行线、反平行线或平行和反平行氨基酸链，以及（ｉｉ）靶结合区Ｉ及靶结合区ＩＩ，与上述结构稳定化区的两个末端结合，并包含随机选择的各ｎ及ｍ个氨基酸；（ｂ）使上述文库和靶接触的步骤；以及（ｃ）选择与上述靶结合的双齿肽结合物的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】KR10-2008-01026482008年10月20日1.一种双齿肽结合物，特异性地与靶结合，其特征在于，该双齿肽结合物包含：(a)β-发夹基序或亮氨酸拉链基序作为结构稳定化区，其包含平行氨基酸链或反平行氨基酸链，其中所述氨基酸链具有链间非共价键；以及(b)靶结合区I及靶结合区II，所述靶结合区I与上述结构稳定化区的两个末端中的一端结合，所述靶结合区II与上述结构稳定化区的两个末端中的另一端结合，其中所述靶结合区I及靶结合区II是具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列是由基于噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示而针对靶标对双齿肽结合物的筛选鉴别出的，所述双齿肽结合物的结构稳定化区与(a)中所述的结构稳定化区相同，且其中所述靶结合区I及所述靶结合区II的氨基酸残基数分别是2～50的整数，其中所述结构稳定化区和靶结合区包含α氨基酸，且其中所述靶为生化物质、细胞或组织。2.根据权利要求1所述的双齿肽结合物，其中所述生化物质为肽、核酸、碳水化合物或脂质。3.根据权利要求2所述的双齿肽结合物，其中所述肽为多肽。4.根据权利要求1～3之任一项所述的双齿肽结合物，其特征在于，链间非共价键包括氢键、静电相互作用、疏水性相互作用、范德瓦尔斯相互作用、π-π相互作用、阳离子-π相互作用或它们的组合。5.根据权利要求1～3之任一项所述的双齿肽结合物，其特征在于，上述结构稳定化区中的氨基酸链通过连接物互相连接。6.根据权利要求1～3之任一项所述的双齿肽结合物，其特征在于，上述结构稳定化区为β-发夹基序。7.根据权利要求6所述的双齿肽结合物，其特征在于，上述β-发夹基序包含选自序列目录第1序列至第19序列的氨基酸序列。8.根据权利要求7所述的双齿肽结合物，其特征在于，上述β-发夹基序包含选自序列目录第2序列、第14序列或第18序列的氨基酸序列。9.根据权利要求6所述的双齿肽结合物，其特征在于，上述β-发夹基序以如下的通式I表示：通式IX1-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7其中，X1为Ser或Gly-Glu，X2及X'2相互独立地为Thr、His、Val、Ile、Phe或Tyr，X3为Trp或Tyr，X4为I型、I'型、II型、II'型或III型或III'型换向序列，X5为Trp或Phe，X6为Trp或Val，X7为Lys或Thr-...

【专利技术属性】
技术研发人员：全相镕，
申请(专利权)人：光州科学技术院，
类型：发明
国别省市：KR