用于口蹄疫的合成肽疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种肽组合物作为免疫原的应用，其中含有的每种肽包含一种来源于口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）ＶＰ１衣壳蛋白的目标抗原位点。该抗原位点与一种辅助Ｔ细胞表位，以及优选与其它免疫刺激序列共价连接，优选通过直接合成的常规肽键共价连接，用于预防ＦＭＤＶ感染和根除口蹄疫（ＦＭＤ）。更具体地说，本发明专利技术涉及应用该肽组合物作为免疫原，在动物包括猪、牛、羊、山羊和易感野生动物品种中诱导产生高效价多克隆抗体，该抗体能够在体外有效地中和ＦＭＤＶ的多种病毒株或血清型，以及应用该组合物作为疫苗，防止、和／或减少无论何种血清型的ＦＭＤＶ感染的发生率，并因此实现根除ＦＭＤ。本发明专利技术还涉及组合物中应用的肽，以及含有一种或多种该肽的免疫分析和／或诊断试剂盒，以及应用该材料在哺乳动物中诊断ＦＭＤＶ的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肽组合物作为免疫原的应用，其中包含的每种肽包括一种来源于口蹄疫病毒(FMDV)VPI衣壳蛋白的目标抗原位点，所述抗原位点共价连接一种辅助T细胞表位，以及优选地，优选通过常规肽键经直接合成连接其它免疫刺激序列，用于预防FMDV感染和根除口蹄疫(FMD)。更具体地说，本专利技术涉及应用该肽组合物作为免疫原在动物包括猪、牛、羊、山羊、和易感野生动物品种中诱导高效价的多克隆抗体，该抗体能够在体外中和FMDV的多种株系或血清型，以及应用该组合物作为预防和/或减少不论何种血清型的FMDV感染的发生率。本专利技术还涉及用于该组合物的肽，以及含有一种或多种所述肽或其片段的免疫分析和/或诊断试剂盒。
技术介绍
口蹄疫(FMD)是一种最有经济影响的家畜疾病。偶蹄目偶蹄动物，例如牛、猪、羊和山羊易受感染。致病因子，口蹄疫病毒(FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族(其正有义RNA基因组编码四种衣壳蛋白(VP1-VP4)和非结构多肽)的一种口疮病毒。附图说明图1示意地显示了FMDV基因组，衣壳和非结构蛋白的编码区，以及蛋白质被剪切的加工途径。FMD随着感染和接触动物的隔离检疫和销毁以及通过使用化学灭活的病毒组合物免疫得以控制。配制这种疫苗的重大困难在于FMDV的显著的抗原多样性。已经描述了七种不同的血清型A、O、C、Asia、和南非型SAT-1、2、和3，它们中的每一种还可以继续分成多种亚型。血清型A、O、和Asia型最为常见。血清型A病毒最多变种，具有超过30中亚型。血清型之间没有交叉保护，因此从感染中恢复的动物或用一种血清型病毒接种的动物仍然容易被其它六种血清型的病毒感染。而且，在一种血清型中抗原变异的程度如此之大，以至有效地抗一种亚型的疫苗可能对同一血清型中的另一种亚型没有保护性。因此，目前的疫苗是基于含有各种参照株系的相关血清型或亚型的灭活病毒的混合物，所述参照株系通过监测局部流行中的病毒株系来确定。需要对野生分离株包括出现的变异体之间的抗原关系进行周期性监视，并且需要能够用于疫苗制品的病毒，以防止爆发。因此，目前疫苗的生产需要生长几种病毒株系并对其灭活，同时确保它们每一种的效力，必须用最新的野生株系周期性重新配制该产品，以防止由于新变异体的出现丧失保护效力。在面对抗原变异的情况下，用于维持免疫原功效的制备多病毒株的方法导致制造期间病毒株对病毒株之间效力及产量的不确定的问题。周期性依次改变灭活病毒疫苗的需要在疫苗制造上产生新的缺点。当将疫苗改变成适应一种新发展的野生株系引起的爆发时，爆发株系必须经人工调整以使其在组织培养中有效生长。适应组织培养的筛选方法会导致保护性免疫原性的减小，导致生产的进一步延迟。(Barteling和Breeswijk，疫苗，1991；975-88；Brown，疫苗，1992；101022-1026)。灭活FMDV疫苗的其它明显缺点与生物安全性和稳定性问题有关。病毒必须在高度密封的设备中生产，以防止污染周围环境。这种潜在的危害将有资格的疫苗供应商限制为极少的数目，并限制了疫苗的可用供应性，并妨碍世界上以前不存在FMDV的区域爆发FMD时的应变能力。这种灭活病毒制品的无害性不能绝对保证。最近欧洲的几起疾病事件追溯到不完全灭活病毒。这种危害导致无此疾病的区域不推荐使用该类疫苗，导致以前未被感染的区域缺乏免疫保护。产品的不稳定性及各批产品间的变异性来源于灭活病毒疫苗的复杂及不明确的组成。这些复杂混合物必须在固定时间进行检查，以确保免疫效力。在某些国家，这可以每年进行三次。需要一种冷箱以维持这种不稳定产品的效力，通常这在某些国家难以得到保证。存在有害效果的可能性是这种复杂组合物的另一种结果。过敏性休克虽是不常发生的问题，但一旦发生就足以造成严重问题。这些缺点已由Brown(《小核糖核酸病毒感染和检测的分子方面》(MolecularAspects of Pic或navirus Infection and Detection)第11章，Semler和Ehrenfeld编，美洲微生物协会Washington，DC，1989，pp 179-191)综合回顾。由于目前FMDV疫苗的复杂组成导致的其它缺点是它不能通过血清学实验分辨被免疫动物和已感染动物(Lubroth等，疫苗，199614419-427)。基于位点特异性免疫原的疫苗将有利于设计分辨疫苗诱导抗体和感染诱导抗体的免疫诊断试剂盒，并因此确保接种程序的有效性。现有商业疫苗的缺点鼓励用更安全更明确的亚单元制品取代它们的研究。然而，为了达到接受性，这些制品将必须与目前提供的灭活病毒疫苗具有相同的免疫原性，并且将需要提供对抗抗原变异体的广泛的保护谱。设计一种用于FMDV的明确亚单元疫苗的努力从打碎病毒颗粒开始，然后鉴定其组成蛋白质，如图1所示。这导致与完整灭活病毒颗粒相比，免疫活性明显丧失(Brown，1989)。然而，发现单独的衣壳蛋白(目前被统一命名为VP1)自身接种的牛和猪具有诱发中和抗体和免疫的能力，虽然其活性为亚型特异性的及数量级低于完整灭活病毒的数量级。没有其它病毒蛋白质诱发中和活性(Lapore等，CRAcad Sci Paris，1973；2763399-3401和Bachrach等，免疫学杂志，1975，1151636-1641)。VP1的中和活性使人们将注意力集中于该蛋白质，而且一开始它就被慎重地考虑为基因工程亚单元疫苗的侯选物(Kleid等，科学，19812141125-1129)。近来清楚地认识到重组VP1的免疫原性不足以保护动物(Brown，1989；Brown，1992)。尽管如此，这项工作导致VP1上免疫决定簇的发现，使基于合成肽的更强效区域特异性亚单元疫苗成为可能。Strohmaier等(J Gen Virol，1982；59295-306)实验了通过溴化氰和蛋白水解消化产生的VP1的酶切产物；Bittle和Lerner(WO83/03547)实验了相应于最高变异性区域的氨基酸序列的合成肽；Acharya等(自然，1989，337709-711)通过X-射线结晶照相术验证了FMDV上的表面暴露位点；Pfaff等(EMBO J，1982，7869-874)通过预测一种VP1的重要两亲螺旋构型筛选出一种诱导中和抗体的肽，由此对VP1的免疫原区进行了作图。所有这四项研究得出VP1的一种具有137-160个残基的环形区域携带诱导中和抗体的决定簇。对应于VP1的141-160区域的血清型-特异性肽，也被称为“G-H环”，得自所有七种血清型的FMDV分离株，已显示在豚鼠中诱导保护水平的中和抗体(Francis等，免疫学，1990，69171-176)。显然该区域含有一种主要的免疫原性位点，其也携带病毒的血清型特异性。通过结合于载体蛋白KLH(匙孔帽贝血蓝蛋白)的合成肽实现了对这种141-160VP1肽的免疫原性的最初观察，此过程忽略了生产明确定义的合成免疫原的优点。然而，DiMarchi和Brook(US专利号4732971)表明来源于亚型O分离株的、连接在200-213 Pro-Pro-Ser-141-158-Pro-Cys-Gly嵌合构建体中的两个VP1序列，诱导保护牛抵抗接种的抗体水平，由此他们推动VP1合成免疫原的发展。尽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选自下组的肽：（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；（ｉｉ） 肽，其是ＦＭＤＶ病毒株而不是ＦＭＤＶ Ａ↓［１２］病毒株ＶＰ１蛋白质的片段，并且其与ＦＭＤＶ Ａ↓［１２］病毒株ＶＰ１蛋白质的氨基酸１３４－１６８同源；（ｉｉｉ） 肽， 具有来源于血清型Ａ、Ｏ或Ａｓｉａ的ＦＭＤＶ病毒株ＶＰ１蛋白质的氨基酸序列的共有序列，其相应于ＦＭＤＶ Ａ↓［１２］病毒株ＶＰ１蛋白质的１３４－１６８位氨基酸；（ｉｖ） 肽，符合ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ∶１４，１６，１８，和２０的定义；和 （ｖ） 肽，满足上述（ｉ）至（ｉｖ）的定义，其中相应于ＦＭＤＶ Ａ↓［１２］病毒株ＶＰ１蛋白质的氨基酸１３４和１５７位置上的氨基酸由半胱氨酸取代。

【技术特征摘要】
US 1998-6-20 09/100,6001.一种选自下组的肽(i)SEQ ID NO1；(ii)肽，其是FMDV病毒株而不是FMDV A12病毒株VP1蛋白质的片段，并且其与FMDV A12病毒株VP1蛋白质的氨基酸134-168同源；(iii)肽，具有来源于血清型A、O或Asia的FMDV病毒株VP1蛋白质的氨基酸序列的共有序列，其相应于FMDV A12病毒株VP1蛋白质的134-168位氨基酸；(iv)肽，符合SEQIDNOS14，16，18，和20的定义；和(v)肽，满足上述(i)至(iv)的定义，其中相应于FMDV A12病毒株VP1蛋白质的氨基酸134和157位置上的氨基酸由半胱氨酸取代。2.一种具有一种氨基酸序列的肽，包括(i)权利要求1的肽的氨基酸序列，和(ii)辅助T细胞表位(Th)的氨基酸序列。3.一种具有一种氨基酸序列的肽，包括(i)权利要求2的肽的氨基酸序列，和(ii)一种一般免疫刺激序列的氨基酸序列。4.权利要求1的肽，其中相应于FMDV A12病毒株VP1蛋白质的氨基酸134和157位置上的氨基酸由半胱氨酸取代。5.权利要求4的肽，其中至少一种肽选自SEQ ID NO2或来源于其它FMDV病毒株的同源序列。6.权利要求4的肽，其中该肽进一步包括1-13个来自VP1的134-157片段任意末端的附加氨基酸。7.权利要求6的肽，其中至少一种肽选自SEQ ID NO3或来源于其它FMDV病毒株的同源序列。8.权利要求1的肽，其中FMDV VP1目标抗原位点选自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ IDNO29、和SEQ ID NO30。9.一种构建的合成抗原文库，其中所述文库包括多种选自下组的肽SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、和SEQID NO35。10.一种由下式代表的肽或肽偶联体(A)n-(FMDV抗原)-(B)o-(Th)m-X或(A)n-(Th)m-(B)o-(FMDV抗原)-Ｘ或(FMDV抗原)-(B)o-(Th)m-(A)n-X或(Th)m-(B)o-(FMDV抗原)-(A)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王长怡，沈明，
申请(专利权)人：美国联合生物医学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]