一种用于检测顺反式突变的qPCR检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种用于检测顺反式突变的qPCR检测试剂盒及其使用方法。本申请提供一种引物对，用于检测目的基因的第一突变位点和/或第二突变位点，所述引物对包括匹配第一突变位点上游的通用引物F、匹配第二突变位点野生型序列的下游引物R‑BW和匹配第二突变位点突变型序列的下游引物R‑BM，还包括匹配第一突变位点上游的荧光探针P‑AW和匹配第一突变位点突变型序列的荧光探针P‑AM，所述荧光探针P‑AW和荧光探针P‑AM的荧光基团不同。本发明专利技术中的反应体系将MGB荧光探针和ARMS引物相结合，可以通过荧光信号的有无来判定突变信息及顺反式关系。相比目前的检测方法，首次提出使用荧光定量PCR来检测顺反式关系，其能够2h内完成检测，特异性好，具有成本优势，且操作简便，便于临床操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学，特别是涉及一种用于检测顺反式突变的qpcr检测试剂盒及其使用方法。

技术介绍

1、同一个基因的不同突变的顺反式结构对靶向治疗的敏感性可能是不同的。因此，顺反式检测对靶向用药有很好的指导意义。

2、表皮生长因子受体(egfr)有络氨酸激酶活性，可以调节细胞活动，与肿瘤发生有关。在亚洲人中约一半的非小细胞肺癌患者携带egfr基因敏感突变，可用络氨酸激酶抑制剂类(tki)靶向药物进行治疗。然而在服药一段时间后，大部分患者会出现耐药现象。其中50％的一代耐药患者是由于egfr基因产生了新的突变t790m，导致药物无法与蛋白结合。第三代tki奥希替尼的耐药有部分是因为出现c797s突变，特别是t790m-c797s顺式突变。因此在进行靶向治疗时，对t790和c797位点突变状态和顺反式关系进行检测是至关重要的。通过对这两个位点的检测就可以最大程度的发挥tki药物的治疗效果，同时减少盲目用药降低患者的经济负担。由于第三代tki奥希替尼在t790m突变患者治疗方面的显著优势，越来越多的临床医生已经将egfr基因的t790m和c797本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种引物对，其特征在于，用于检测目的基因的第一突变位点和/或第二突变位点，所述引物对包括匹配第一突变位点上游的通用引物F、匹配第二突变位点野生型序列的下游引物R-BW和匹配第二突变位点突变型序列的下游引物R-BM，还包括匹配第一突变位点上游的荧光探针P-AW和匹配第一突变位点突变型序列的荧光探针P-AM，所述荧光探针P-AW和荧光探针P-AM的荧光基团不同。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述第二突变位点的突变型序列与下游引物R-BM的3’末端匹配；优选地，所述下游引物R-BM的3’末端还包括1～2个碱基错配；

3.根据权利要求1所述的引物对，其...

【技术特征摘要】

1.一种引物对，其特征在于，用于检测目的基因的第一突变位点和/或第二突变位点，所述引物对包括匹配第一突变位点上游的通用引物f、匹配第二突变位点野生型序列的下游引物r-bw和匹配第二突变位点突变型序列的下游引物r-bm，还包括匹配第一突变位点上游的荧光探针p-aw和匹配第一突变位点突变型序列的荧光探针p-am，所述荧光探针p-aw和荧光探针p-am的荧光基团不同。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述第二突变位点的突变型序列与下游引物r-bm的3’末端匹配；优选地，所述下游引物r-bm的3’末端还包括1～2个碱基错配；

3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述荧光探针p-aw或荧光探针p-am为taqma探针，5’端添加荧光报告基团，3’端添加荧光淬灭基团；

4.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述荧光探针p-aw或荧光探针p-am的tm要高于所述引物对中的通用引物f、下游引物r-bw和下游引物r-bm的tm值；优选地，所述荧光探针p-aw或荧光探针p-am的tm值高于所述引物对中的通用引物f、下游引物r-bw和下游引物r-bm的tm值5～10℃。

5.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对还包括阻断型探针b-aw和b-bw，分别与第一突变位点的野生型序列和第二突变位点的野生型序列匹配。

6.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述目的基因选自egfr；优选地，所述目的基因的第一突变位点来自egfr基因20号外显子的t790m或21...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雯，石涵，杨峰，洪跟东，汪有先，
申请(专利权)人：上海睿璟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：