修饰的磷酸酶制造技术

本发明专利技术涉及磷酸酶，且更具体地涉及（遗传）修饰的磷酸酶、包含（遗传）修饰的磷酸酶的药物组合物、和（遗传）修饰的磷酸酶在治疗或治愈如败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、或肾衰竭中的用途。本发明专利技术还涉及制备磷酸酶的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及磷酸酶，且更具体地涉及(遗传)修饰的磷酸酶、包含(遗 传)修饰的磷酸酶的药物组合物、和(遗传)修饰的磷酸酶在治疗或治愈如 败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾病、或肾衰竭中的用途。本专利技术还涉及制 备;寿酸酶的方法。
技术介绍
磷酸酶是对其底物进行去磷酸化的酶；即其将磷酸单酯水解为磷酸根离 子和具有自由羟基基团的分子。此作用与通过使用能量分子如ATP将磷酸根基团连接到其底物上的磷酸化酶和激酶的作用直接相反。磷酸酶可以-皮分 为主要的两类半胱氨酸依赖性磷酸酶(CDP)和金属磷酸酶。后者的活性依赖于在其活性位点上一种或多种金属离子的存在。CDP通过磷酸-半胱氨酸中间产物催化磷酸酯键的水解。游离的半胱氨 酸亲核试剂与磷酸根部分的磷原子成键，并通过合适位置的酸性氨基酸残基 或水分子将连接磷酸根基团和酪氨酸的P-O键质子化。磷酸-半胱氨酸中间 产物随后被另 一水分子水解，由此产生用于另 一去磷酸化反应的活性位点。金属磷酸酶与其活性位点内的一个或多个催化必需的金属离子配位。目 前对这些金属离子的鉴定存在一些混乱，原因是不断尝试去鉴定它们但得出 了不同的答案。目前证据表明这些金属可能是镁、锰、铁、锌或其任意组合。 认为桥接两金属离子的氢氧根离子参与了对磷酸根基团的亲核攻击。磷酸酶发挥与将磷酸根基团添加到蛋白质上的激酶/磷酸化酶相反的作 用。磷酸根基团的添加可以活化或去活化酶(如激酶信号通路)，或使蛋白 质-蛋白质相互作用发生(如SH3结构域)；因此磷酸酶是许多信号转导通路所必需的。应该注意到磷酸根的添加和去除并非必需对应酶的活化或抑制，且一些酶具有用于活化或抑制功能性调节的单独磷酸化位点。例如，CDK的活化或去活化依赖于被磷酸化的特定氨基酸残基。磷酸根在信号转导中很 重要，因为它们调节与其相连的蛋白质。将磷酸根去除以逆转该调节作用。 这可以通过水解自行发生，或受蛋白质磷酸酶的调节。并非限制本专利技术，将碱性磷酸酶作为本文所述和要求保护的磷酸酶的实例进行详细讨论。碱性磷酸酶(ALP) (EC3.1.3.1)是负责从包括核苷酸、 蛋白质和生物碱的多种分子中去除磷酸根基团的水解酶。去除磷酸根基团的 过程被称为去磷酸化。顾名思义，碱性磷酸酶在碱性环境下最有效。因为DNA通常在5'端具有磷酸根基团，所以碱性磷酸酶已成为分子生 物学实验室中一种十分有用的工具。去除这些磷酸根防止了 DNA的连接(5' 端连接相同或另一分子的3，端)；此外，磷酸根基团的去除使得可以进行放 射标记(被放射活性磷酸根基团替代)，以通过方法或实验中的其它步骤测 定被标记DNA的存在。出于这些目的，来自虾的碱性磷酸酶最有用，因为 其一旦完成其使命则最易被去活化。碱性磷酸酶的另一重要用途是作为酶免疫分析的标记物。 此外，碱性磷酸酶可以用在如败血症、炎性肠疾病或肾衰竭的治疗中。 虽然现有的(碱性)磷酸酶在诊断学和疾病治疗中都十分有用，但是仍 需具有如改变的(如改进的)比活性、稳定性(如体内T1/2、或储存(货架 期)方面的稳定性)或底物特异性的备选磷酸酶。此外，也需要具有不同的 pH或温度或盐依赖性分布，或不依赖pH或温度或盐的磷酸酶。
技术实现思路
本专利技术提供了备选的(遗传)修饰的磷酸酶。在第一实施方案中，本专利技术提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离 或重组的碱性磷酸酶，其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的 碱性磷酸酶。这些突变体在本文中也称为结构域交换突变体。碱性磷酸酶(AP)(根据IUBMB酶命名法为EC3.1.3.1,常用名为碱 性磷酸酶)是催化磷酸单酉旨(phosphatase monoester)和1120反应生成醇和 磷酸根的酶。AP的其它名称为碱性磷酸单酯酶、磷酸单酯酶、甘油磷酸酶、 碱性磷酸水解酶、碱性苯基磷酸酶、正磷酸单酯磷酸水解酶(最适宜碱性)。 AP的系统名称为磷酸单酯磷酸水解酶(最适宜碱性)。AP是广谱特异性酶，其也可以催化转磷酸作用。已知在人类和其它哺 乳动物中已知有至少四类不同但相关的碱性磷酸酶。在人类中，它们是肠、 胎盘、胎盘样和肝/骨/肾(或组织非特异性)碱性磷酸酶。前三类一起位于 2号染色体上，而组织非特异性形式则位于1号染色体上。尚不知道AP的 确切生理学功能，但AP似乎参与大量生理学过程。胎盘碱性磷酸酶在本文 中简称为ALPP或PLAP。简称ALPI或IAP是指肠碱性磷酸酶。胎盘样2 碱性磷酸酶在本文中简称为ALPP2、 ALPG或GCAP,且简称ALPL、 TNSALP、 TNAP或BLK在本文中用来指肝/组织非特异性碱性磷酸酶。用 于一种和相同碱性磷酸酶的不同缩写在本文中可以交换使用。从构象上看，碱性磷酸酶大致由两个结构域构成花冠结构域和活性位 点结构域。活性位点结构域可以分为单独的部分，如催化残基和三个金属离 子位点(Znl、 Zn2和Mg3)。从一级结构看，很明显花冠结构域侧翼连接 形成活性位点结构域的氨基酸。因此，在优选的实施方案中，催化结构域不 由连续的氨基酸序列构成，而是侧翼连接花冠结构域。碱性磷酸酶的氨基酸序列和催化和花冠结构域的相对位置是技术人员 已知的。例如，参考附图说明图1，其显示出四条人碱性磷酸酶的氨基酸序列。这些 序列中的花冠结构域用下划线标出。本专利技术的结构域交换突变体优选通过用 另一磷酸酶的花冠结构域(下划线标出)替换其自身花冠结构域(下划线标 出)来制备。例如，ALPP花冠结构域位于氨基酸366至430位之间，因此 在优选的实施方案中，参照对应于图1中氨基酸366至430位的花冠结构域， 即在优选的实施方案中，本专利技术提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离 或重组的碱性磷酸酶，其中所述花冠结构域和所述催化结构域是获得自不同的碱性磷酸酶，且图1的ALPP中的花冠结构域位于氨基酸366至430位之间。碱性磷酸酶存在于从细菌到人类的几乎所有生物体中。在优选的实施方 案中，本专利技术提供了包含花冠结构域和催化结构域的分离或重组的碱性磷酸 酶，其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶，且其 中所述不同的磷酸酶中的至少一种是人磷酸酶。另 一种磷酸酶是如ECAP(大 肠杆菌(^c/zen'c/z/co//)石成性磷酸酶)或七种已知BIAP (牛肠碱性磷酸酶) 中的一种。在优选的实施方案中，本专利技术提供了包含花冠结构域和催化结构 域的分离或重组的碱性磷酸酶，其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得 自不同的碱性磷酸酶，且其中所述不同的碱性磷酸酶是人磷酸酶。如果修饰 的磷酸酶随后用在人类治疗中，例如用在败血症、炎性肠疾病或其它炎性疾 病、或肾衰竭治疗中，这一点将特别有用。预期此(遗传)修饰的人源磷酸 酶没有免疫原性或免疫原性很低。然而，技术人员清楚如果将修饰的磷酸酶 用在如体外，，或离体，，诊断中，修饰的磷酸酶可以由如人和大肠杆菌碱性磷酸酶构成，或可以由牛和大肠杆菌石威性磷酸酶构成。在另一个优选的实施方案中，本专利技术提供了包含花冠结构域和催化结构 域的分离或重组的碱性磷酸酶，其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得 自不同的碱性磷酸酶，且其中所述花冠结构域是ALPP花冠结构域，且其中 所述催化结构域是ALPI催化结构域。优选地，所述不同的磷酸酶中的至少 一个是人磷酸酶，且在更优选的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离或重组的碱性磷酸酶，所述碱性磷酸酶包含花冠结构域和催化结构域，其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-4-27 07107176.5;US 2007-4-27 60/926,6951、一种分离或重组的碱性磷酸酶，所述碱性磷酸酶包含花冠结构域和催化结构域，其中所述花冠结构域和所述催化结构域获得自不同的碱性磷酸酶。2、 如权利要求1所述的磷酸酶，其中至少一种所述的不同磷酸酶是人磷酸酶。3、 如权利要求l或2所述的磷酸酶，其中所述花冠结构域是ALPP花冠结 构域，且其中所述催化结构域是ALPI催化结构域。4、 如权利要求1或2所述的磷酸酶，其中所述花冠结构域是ALPI花冠结 构域，且其中所述催化结构域是ALPP催化结构域。5、 一种分离或重组的磷酸酶，所述磷酸酶在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号 序列中包含修饰，其中所述修饰导致分泌性磷酸酶。6、 如权利要求5所述的磷酸酶，其中所述修饰包括含有共有GPI信号序列 的氨基酸序列的突变或删除。7、 如权利要求5或6所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是人磷酸酶。8、 如权利要求5至7中任一项所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶。9、 如权利要求5至8中任一项所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶选自人肝-肾-骨磷酸酶、人肠碱性磷酸酶或人胎盘样碱性磷酸酶。10、 如权利要求5至9中任一项所述的磷酸酶，还包含获得自不同磷酸酶 的花冠结构域和催化结构域。11、 一种分离或重组的磷酸酶，所述磷酸酶在催化残基附近和/或在金属离 子配位磷酸根结合的穴中包含突变。12、 如权利要求11所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是人磷酸酶。13、 如权利要求11或12所述的磷酸酶，其中所述磷酸酶是碱性磷酸酶。14、 如权利要求11至13中任一项所述的磷酸酶，其中所述突变是如表4、 5或6中所示的突变。15、 如权利要求11至14中任一项所述的磷酸酶，还包含在糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列中的修饰，其中所述修饰导致非GPI锚定的磷酸酶。16、 如权利要求11至14中任一项所述的磷酸酶，还包含获得自不同磷酸 酶的花冠结构域和催化结构域。17、 如权利要求15所述的磷酸酶，还包含获得自不同磷酸酶的花冠结构域 和催化结构域。18、 一种编码如权利要求1至17中任一项所述的磷酸酶的核酸序列。19、 一种包含如权利要求18所述的核酸的载体。20、 一种包含如权利要求18所述的核酸或如权利要求19所述的载体的宿 主细胞。21、 一种用于制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：马克温保罗韦尔德斯，路易吉约翰内森科尼利厄斯琼克，威兰姆拉本，马提贝尔纳杜斯弗朗西斯库斯武尔费林，
申请(专利权)人：安法玛公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]