一种低温碱性磷酸酶及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及一种新的碱性磷酸酶及其制备方法。本发明专利技术将如序列表ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１所示的低温碱性磷酸酶的ｃＤＮＡ序列克隆到基因工程载体，表达，获得低温碱性磷酸酶。本发明专利技术依据大肠杆菌的密码子偏爱理论对ＴＡＢ５低温碱性磷酸酶的ＤＮＡ序列进行改造，使其在大肠杆菌中高表达，使用镍亲和层析和离子交换层析法对碱性磷酸酶进行纯化，最终可从每升大肠杆菌菌液中得到纯度在９９％以上的ＴＡＢ５碱性磷酸酶９０ｍｇ以上。本发明专利技术可应用于生命科学领域分子生物学领域的研究，特别是需要将碱性磷酸酶热失活的多步反应，如ＤＮＡ测序前的样品处理等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种DNA序列。具体而言，本专利技术涉及一种存在于 南极细菌株TAB5的碱性磷酸酶Alkaline Phosphatase (TAB5-AP)，还涉及该酶在大肠杆菌 表达系统中的表达和纯化蛋白的方法。
技术介绍
碱性磷酸酶是广泛存在于各种生物体中的非特异性酶，在生物体中具有重要作 用。大多数碱性磷酸酶均是一个两个相同的亚基组成的同型二聚体，在酶的中间部分有10 组β折叠的保守序列。碱性磷酸酶作为实验室普遍使用的一种酶，常用于在分子克隆中非 特异性地脱磷酸基团，减弱来自空载体或重组载体的环境。被磷酸酶处理过的片段缺少5’ 的磷酰基标志，因此能够避免自我环化，降低合成时环境方向性的影响。该酶可经加热灭活 完全去除，另外作为限制酶时在所有缓冲液中都有活性，所以被广泛应用于科学研究中。此 外，碱性磷酸酶作为一项重要的生理健康指标，在临床医学上有着较大的重要性。目前国内 外均有对医学检测碱性磷酸酶指标的研究。目前碱性磷酸酶在科学研究及临床应用中已经起着不可替代的作用。并随着 实验的需要逐步被改进。一个好的碱性磷酸酶不仅能够缩短实验周期、化简实验步骤， 同时能增加基因克隆实验的效果。该酶可经加热灭活去除，另外作为限制酶时在所有缓 冲液中都有活性。目前研究最多、应用范围最广的是从虾中提取的碱性磷酸酶Sirimp Alkaline Phosphatase.但该酶的获取成本较高，而且容易在反应中逐渐失活。另一种 酶Calf Intestinal Alkaline Phosphotase不能热失活，故容易引起实验失败，影响研 究进度。目前研究最多、应用范围最广的是从虾中提取的碱性磷酸酶Shrimp Alkaline Phosphatase(SAP)。该碱性磷酸酶的DNA序列和晶体结构已经被揭示，相关蛋白质功能的 研究成果也陆续发表。SAP与外切核酸酶一起，为DNA测序或基因分型前从PCR产物中去除 核苷酸和引物提供了最简单、最安全和最高效的方法。但该酶的获取成本较高，而且容易在 反应中逐渐失活。另一种也广泛使用的酶Calf Intestinal Alkaline Phosphotase (CIAP) 不能热失活。因此需要寻找更好的酶进行替代。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有碱性磷酸酶的不足，选取已公布的、证明具有良好 失活特性的低温碱性磷酸酶TAB5-AP，根据原核表达系统中的大肠杆菌密码子偏爱理论，重 新设计了该酶的DNA序列，从而提高该酶在原核系统中的表达以及在纯化流出中的效果。本专利技术在现有磷酸酶TAB5-AP的cDNA序列前加上了 10个组氨酸的DNA序列。组 氨酸能够特异性的与镍柱结合，帮助蛋白纯化。根据大肠杆菌对氨基酸三联密码子的第三 位碱基的特定偏爱，对该氨基酸的密码子进行同义突变，将第三位碱基替换成大肠杆菌偏 爱的碱基，修改了 TAB5-AP的原始序列。当该序列的核苷酸序列在原核系统中表达时，由于 大肠杆菌对替换的密码子具有偏好，从而能够提高蛋白的表达效率，提高目的蛋白在大肠杆菌体内的表达产量。本专利技术提供了一种低温碱性磷酸酶的制备方法，即将如序列表SEQ ID NO 1所示 的低温碱性磷酸酶的cDNA序列克隆到基因工程载体，表达，获得低温碱性磷酸酶。本专利技术对现有的低温碱性磷酸酶TAB5-AP的DNA序列的密码子进行了优化，优化 改进的内容1)依据大肠杆菌的密码子偏好理论，对氨基酸三联密码子的第三位碱基进行了同 义替换。2)依据大肠杆菌存在的多密码子偏好，同一核苷酸位点存在多个碱基替换。还可以在序列N端和(或)C端能够根据需要接上不同的蛋白标签。较好的，在该 酶cDNA的N端带有10个组氨酸的DNA序列片段，以便于纯化分离。组氨酸片段的长短和 在N端和(或)C端的位置能够根据具体情况进行调整。本专利技术的低温碱性磷酸酶的表达在室温或低温下进行，从而节省了能源和制备成 本。得到纯化的蛋白溶液，其中蛋白纯度99.0%。每升菌液得到蛋白90mg以上。具体而言，首先，合成如序列表SEQ ID NO 1所示的低温碱性磷酸酶的cDNA序列， 即本专利技术的低温碱性磷酸酶的核苷酸编码序列；然后，利用基因工程方法在18 25°C诱导 表达过夜；最后，分离纯化低温碱性磷酸酶。其中，合成低温碱性磷酸酶的核苷酸编码序列时，可以逐个添加，也可以先合成若 干小片段，然后再将这些片段按照SEQ ID NO 1连接。其中，基因工程方法通常指，将目标DNA片段克隆到载体的多克隆位点，然后转入 宿主复制表达。所用的的载体、宿主及相关试剂都可以采用基因工程领域常规的材料。载 体可以使用常规的pet系列载体，如质粒pET28A，宿主细胞可以采用大肠杆菌BL21，DH5 α寸。其中，分离纯化的过程可以采用常规技术，也可以按照如下步骤进行1)将表达低温碱性磷酸酶的宿主菌破菌、离心分离出蛋白；2)将步骤(1)中的上清液使用Ni-NTA亲和层析柱纯化，去除杂蛋白；3)将步骤( 获得的蛋白洗脱液使用Q离子交换柱进行纯化。其中，去除杂蛋白可以通过高效液相色谱技术实现。可以去除杂蛋白后的蛋白洗脱液用透析法对蛋白溶液进行置换。也可以将所得蛋 白洗脱液使用Q离子交换柱进一步纯化。本专利技术还包括对分离纯化后的低温碱性磷酸酶的蛋白溶液进行浓缩。所述的浓缩 可以使用本领域的常规技术，例如用超滤渗析法对蛋白溶液进行浓缩。本专利技术提供了一种新型的低温碱性磷酸酶，其核苷酸编码序列如SEQ ID NOl所7J\ ο本专利技术还提供了含有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸编码序列的表达载体或者克隆 载体。本专利技术的制备方法得到的纯化的低温碱性磷酸酶蛋白溶液，其中蛋白纯度通常在 92%以上，较好的能够达到95%，甚至99.0%以上，每升菌液得到蛋白90mg以上。为了克服现有碱性磷酸酶的不足，本专利技术选取已公布的、证明具有良好失活特性 的低温碱性磷酸酶TAB5-AP，根据原核表达系统中的大肠杆菌密码子偏爱理论，重新设计了该酶的DNA序列，从而提高该酶在原核系统中的表达以及在纯化流出中的效果。得到纯化 的蛋白溶液，其中蛋白纯度99.0%。每升菌液得到蛋白90mg以上。本专利技术的低温碱性磷酸 酶的制备方法，操作简便，节能高效，对生产条件和设备要求都较低。本专利技术可广泛应用于 生命科学领域分子生物学领域的研究，特别是需要将碱性磷酸酶热失活的多步反应，如DNA 测序前的样品处理等。本专利技术为工具酶的生产提供一种新方法和新思路，使得其能够应用于商业生产和 科学研究中。本专利技术的有益效果是大大提高了该低温碱性磷酸酶在原核表达系统中的产 量，对该酶的商业化生前景有决定性意义。具体实施例方式使用聚合酶链式反应polymerase chain reaction(PCR)法对TAB5-AP序列进 行扩增，用限制性内切酶对该片段和载体质粒进行消化，再将片段接入载体中，构建带有 TAB5-AP片段的质粒。最后转入到大肠杆菌感受态中进行正筛选。挑阳性单克隆后在含有lOOug/ml氨苄霉素的5ml LB培养液中活化过夜，随后转 至IL自动诱导培养基中，先于37°C培养4至5个小时，待细菌大量生长后置于20°C低温诱 导表达15个小时。诱导表达后在5，OOOg转速离心20分钟收集细菌。用洗脱N本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种低温碱性磷酸酶，其特征在于，其核苷酸编码序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ　１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁澦，陆致晟，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]