嵌合型碱性磷酸酶样蛋白制造技术

本发明专利技术涉及嵌合型碱性磷酸酶样蛋白，以及改进的碱性磷酸酶、包括改进的碱性磷酸酶的药物组合物，以及改进的碱性磷酸酶在预防、治疗或治愈疾病中的用途。本发明专利技术提供的改进的磷酸酶具有改善的性能。

【技术实现步骤摘要】
嵌合型碱性磷酸酶样蛋白分案说明本申请是申请日为2015年1月26日、国家申请号为201580016357.1、专利技术名称为“嵌合型碱性磷酸酶样蛋白”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及具有改善的性能的碱性磷酸酶、包括具有改善的性能的碱性磷酸酶的药物组合物，以及具有改善的性能的碱性磷酸酶在预防、治疗或治愈疾病中的用途。
技术介绍
磷酸酶是使其底物脱磷酸的酶；即，磷酸酶使磷酸单酯水解为磷酸根离子和具有游离羟基的分子。该作用与磷酸化酶和激酶的作用正好相反，所述磷酸化酶和激酶通过使用高能分子如ATP使磷酸基与它们的底物连接。磷酸酶可被划分为两个主要类别：依赖于半胱氨酸的磷酸酶(CDP)和金属磷酸酶。金属磷酸酶通常使2个催化必需的金属离子在它们的活性位点协作。目前对于这些金属离子的身份有一些困惑，因为鉴定它们的连续尝试得出了不同的答案。目前有证据表明这些金属可能是镁、锰、铁、锌或其任意组合。认为桥连这两个金属离子的羟基离子参与对磷酸基上的亲核攻击。磷酸酶与将磷酸基添加到蛋白上的激酶/磷酸化酶的作用相反。磷酸基的添加或去除可以使酶(例如，为通路传递信号的激酶)激活或失活或确保出现蛋白-蛋白相互作用(例如，SH3结构域)；因此磷酸酶对于许多信号转导通路而言是不可或缺的。应该注意到，磷酸添加和去除不一定对应酶的激活或抑制，并且一些酶具有用于激活或抑制功能调控的单独的磷酸化位点。例如，取决于被磷酸化的具体氨基酸残基，CDK可以被激活或失活。磷酸在信号转导中是重要的，因为所述磷酸调控与它们连接的蛋白。为了逆转调控效果，除去磷酸。这通过水解作用独立地发生，或由蛋白磷酸酶介导发生。一类磷酸酶，碱性磷酸酶(ALP或AP)(EC3.1.3.1)，是负责从许多种类型的分子，包括，例如，核苷酸、蛋白和生物碱除去磷酸基的水解酶。直到最近，才认识到碱性磷酸酶在碱性环境中最有效的，如其名字所提示的。在本领域中认为AP的一个可能的生理作用可能是它与炎性分子相互作用。首先已经假设，AP使内毒素脱磷酸并且由此降低了对这些高炎性分子的炎性应答。从那以后，已被假设和探寻了其他的作用机制。然而，直到现在，尽管它在众多炎性疾病和其他疾病中的有益作用，该作用机制还没有被完全阐明。在过去，牛源的碱性磷酸酶已在动物模型和临床试验中用于例如败血症、急性肾损伤、炎性肠病、小肠结肠炎、缺血再灌注损坏或其他炎性疾病的治疗(Riggle等,JSurgRes.2013年3月；180(1):21-6；Peters等,JPharmacolExpTher.2013年1月；344(1):2-7；Martinez-Moya等,PharmacolRes.2012年8月；66(2):144-53；Pickkers等,CritCare.2012一月23日；16(1)；Ramasamy等,InflammBowelDis.2011年2月；17(2):532-42；Lukas等,InflammBowelDis.2010年7月；16(7):1180-6；Bol-Schoenmakers等,EurJPharmacol.2010年5月10日；633(1-3):71-7；Heemskerk等,CritCareMed.2009年2月；37(2):417-23；Tuin等,Gut.2009年3月；58(3):379-87；Su等,CritCareMed.2006年8月；34(8):2182-7；vanVeen等,BrJSurg.2006年4月；93(4):448-56；vanVeen,InfectImmun.2005年7月；73(7):4309-14；Verweij等,Shock.2004年8月；22(2):174-9)。尽管目前可获得从天然来源分离的以及重组改造的、在诊断学和疾病治疗两者中都有用的碱性磷酸酶，但是仍需要具有例如改变的(例如改善的)比活性、稳定性(例如，在体内的T1/2，或储存(货架期)的稳定性)或底物特异性的供选择的磷酸酶。本专利技术提供这样的改进的磷酸酶，所述改进的磷酸酶相较于WO2008/133511中广泛描述的嵌合型重组碱性磷酸酶具有改善的性能。
技术实现思路
在第一实施方式中，本专利技术提供具有磷酸酶活性的分离蛋白，其中所述蛋白包括与SEQIDNO:5具有至少90％的序列同一性的至少200个连续氨基酸的氨基酸序列，与SEQIDNO:6具有至少90％的序列同一性的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，以及与SEQIDNO:7具有至少90％的序列同一性的至少40个连续氨基酸的氨基酸序列，其中全长蛋白包括与SEQIDNO:1的全长氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，条件是279位的氨基酸是亮氨酸(L)，328位的氨基酸是缬氨酸(V)并且478位的氨基酸是亮氨酸(L)。在优选实施方式中，全长蛋白包括与SEQIDNO:1的全长氨基酸序列具有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的氨基酸序列，条件是对应279位的氨基酸是亮氨酸(L)，对应328位的氨基酸是缬氨酸(V)并且对应478位的氨基酸是亮氨酸(L)。本文中术语“对应”意为相对于成熟蛋白的被指定为“1位”的N端氨基酸的特定位置。术语“对应”明确地并不指在该特定位置上的特定氨基酸残基。术语“蛋白”和“多肽”指包括由肽键连接的氨基酸的化合物并且可以互换使用。如在本文中使用，当提及“氨基酸序列”时，它是指蛋白或肽分子的氨基酸序列。“氨基酸序列”可以从编码蛋白的核酸序列推导出。然而，术语如“多肽”或“蛋白”并非意欲将氨基酸序列限于推导出的氨基酸序列，而是可以包括推导出的氨基酸序列的翻译后修饰，如氨基酸缺失、添加和修饰，比如糖基化和添加脂质部分。而且，使用非天然氨基酸，比如D-氨基酸来提高稳定性或药代动力学行为也落在术语“氨基酸序列”的范围内，除非另外指出。优选地，所述蛋白的一部分包括与人PLAP的全长冠状结构域具有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的50-65个、优选地60-65个、更优选地62-65个、更优选地64-65个、最优选地65个连续氨基酸的氨基酸序列。为了本专利技术的目的，对应人PLAP参考序列的全长冠状结构域的氨基酸序列为图1中描述的SEQIDNO:3中加下划线的，并且对应其中的366-430位。优选地，所述蛋白的一部分包括与人ALPI的冠状结构域侧翼的N端区域具有90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的200-365个、更优选地250-365个、更优选地300-365个、更优选地350-365个、更优选地至少360-365、最优选地365个连续氨基酸的氨基酸序列。该冠状结构域侧翼的N端区域被认为是催化结构域的两个部分中的一个。优选地，所述蛋白的一部分包括与人ALPI的冠状结构域侧翼的C端区域具有90％、优选地至少95％、更优选地至少98％的序列同一性的40-54个、优选地45-54个、更优选地50-54个、更优选地52-54个、最优选地54个连续氨基酸的氨基酸序列。该冠状结构域侧翼的C端本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有磷酸酶活性的分离蛋白，其中所述蛋白包括与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性的至少200个连续氨基酸的氨基酸序列，与SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的至少40个连续氨基酸的氨基酸序列，其中全长蛋白包括与SEQ ID NO:1的全长氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，条件是279位的氨基酸是亮氨酸(L)，328位的氨基酸是缬氨酸(V)并且478位的氨基酸是亮氨酸(L)。/n

【技术特征摘要】
20140124 EP 14152526.1;20141008 EP 14188158.11.一种具有磷酸酶活性的分离蛋白，其中所述蛋白包括与SEQIDNO:5具有至少90％的序列同一性的至少200个连续氨基酸的氨基酸序列，与SEQIDNO:6具有至少90％的序列同一性的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，以及与SEQIDNO:7具有至少90％的序列同一性的至少40个连续氨基酸的氨基酸序列，其中全长蛋白包括与SEQIDNO:1的全长氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，条件是279位的氨基酸是亮氨酸(L)，328位的氨基酸是缬氨酸(V)并且478位的氨基酸是亮氨酸(L)。


2.一种包括编码根据权利要求1所述的蛋白的核酸序列的多核苷酸。


3.一种包括根据权利要求2所述的多核苷酸的载体。


4.根据权利要求1所述的蛋白、根据权利要求2所述的多核苷酸或根据权利要求3所述的载体用作药物的用途。


5.根据权利要求4所述的蛋白、多核苷酸或载体在预防或治疗伴有局部或全身性锌缺乏的疾病中的用途。


6.根据权利要求4或5所述的蛋白、多核苷酸或载体的用途，用于预防或治疗炎性疾病、肾病或低磷酸酯酶症。


7.根据权利要求6所述的蛋白、多核苷酸或载体的用途，其中所述炎性疾病选自由自身免疫疾病、类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化、炎性胃肠道疾病、感染、败血...

【专利技术属性】
技术研发人员：威兰姆·拉本，路易吉·约翰内森·科尼利厄斯·琼克，埃瑞克·简·范·德·伯格，安德里亚·范·埃尔萨斯，乔西·路易斯·米兰，
申请(专利权)人：安法玛公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL