一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用，所述酶反应液包括酶组合物和反应缓冲液；所述酶组合物包括核酸内切酶、DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶；所述反应缓冲液包括金属盐、底物和缓冲介质水溶液。本发明专利技术通过优化酶反应液的配方，通过一步反应实现对核酸样本的切割、末端修复和加A尾处理，在适宜的缓冲体系中，酶切反应速率和末端修复反应速率达到平衡，在样本起始量为100pg‑1μg、处理时间相同的情况下，获得了长度分布一致的测序文库。

【技术实现步骤摘要】
一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用。
技术介绍
随着高通量测序成本的大幅下降，高通量测序市场迅速增长。其中，DNA测序约占据整个高通量测序市场的一半，因此人们对于流程简便、快速、高通量的DNA建库技术的需求越来越迫切。DNA建库流程中第一步也是最关键的一步在于将大片段DNA分子无偏向性地片段化为特定长度的小片段DNA，目前主流的DNA片段化方式为超声机械打断。然而超声机械打断仪往往价格昂贵，许多工业、科研、医疗实验室无法配备此仪器；超声机械片段化DNA的操作繁琐、耗时长，需要实时取样检测样品的片段化效果；并且超声机械打断的样品数量少、单次处理样本的投入量少，无法满足工业、医疗领域对大通量处理样品的需求。片段化酶可以很好地解决上述问题，基于酶法的DNA样品处理方法可在热循环仪中完成，操作流程简便、快速；片段化酶能够对DNA分子进行非特异性的随机切割，因此有望替代传统的超声机械法将大片段DNA分子无偏向性地片段化为特定长度的小片段DNA分子，从而应用于高通量测序中的DNA文库构建。目前已有的基于酶法的DNA片段化技术包括：1)使用Vvn在双链DNA分子上随机产生缺刻、同时利用T7核酸内切酶在缺刻位点将另一条DNA分子切开；2)使用DNaseI在Mn2+或Mg2+存在的情况下将双链DNA断裂；3)将多种识别特定碱基序列的限制性核酸内切酶(比如MspI、AluI、CviQI、MseI、MlucI、HaeIII等)混合，进行对DNA分子的切割。当前，构建DNA文库的样本起始投入量从100pg～1μg不等，存在5个数量级的差异，而市面上的商业化试剂盒在起始量兼容性方面均不足以满足市场需求。一方面商业化的试剂盒的兼容下限均在100pg以上，另一方面不同的起始量需要使用不同的反应时间。在实际的实验过程中，从不同的样本中获得的核酸量是不同的，不可避免地会使用不同起始量的样本进行文库构建。因此，针对不同的样本起始量，需要调整反应时间，不仅增加了实验的繁琐程度和对仪器的需求量，而且也限制了文库构建方法在大通量样本方面的应用。CN108998434A公开了片段化酶打断缓冲液及提高片段化酶打断效率的方法，所述片段化酶打断缓冲液包括适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分和终浓度为10％以下的PEG8000，以及终浓度为10-25mM的Mg2+，通过在反应缓冲液体系中添加不同比例的PEG及Mg2+来调节DNA片段化的效率及片段大小，得到可满足BGISEQ-500平台PE100和PE150双端测序文库要求的打断缓冲液，但是仍然不能兼容起始量为100pg～1μg的样本。因此，有必要对现有的文库构建试剂盒进行改进。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种用于构建测序文库的酶反应液及其应用，所述酶反应液通过优化酶组合物的种类和用量，并与反应缓冲液中的金属离子和缓冲介质相互配合，平衡了文库构建过程中的酶切反应速率和末端修复反应速率，实现了在样本起始量不同、处理时间相同的情况下，获得长度一致的测序文库的技术效果，具有广泛的适用性和便捷的操作性。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种用于构建测序文库的酶反应液，所述酶反应液包括酶组合物和反应缓冲液；所述酶组合物包括核酸内切酶、DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶；所述反应缓冲液包括金属盐、底物和缓冲介质水溶液。本专利技术的酶组合物包括用于进行切割的核酸内切酶、用于进行末端修复和3’加A尾的DNA聚合酶、以及用于进行5’磷酸化的多聚核苷酸激酶，所述酶组合物集中在一个反应体系中，通过一步反应实现对核酸样本的切割、末端修复和加A尾处理，反应缓冲液中既包含切割反应所需的离子缓冲液，又包含末端修复所需的离子缓冲液，而且还含有各类反应所需的底物分子dNTPs、dATP和ATP，各种组分在一定的浓度范围内相互配合，平衡酶切反应速率和末端修复反应速率，实现了在样本起始量为100pg-1μg、处理时间相同的情况下，获得长度一致的测序文库的技术效果。本专利技术采用核酸内切酶对核酸样本进行切割，所述核酸内切酶例如可以是核酸内切酶dsDNase、T7核酸内切酶、盐活性核酸内切酶SAN、核酸内切酶Vvn或核酸内切酶DNaseI中的任意一种或至少两种的组合。在一些实施方案中，所述核酸内切酶例如可以是来源于虾的核酸内切酶dsDNase、来源于T7噬菌体的核酸内切酶T7Endonuclease、盐活性核酸内切酶SAN、来源于创伤弧菌的核酸内切酶Vvn或来源于牛胰的核酸内切酶DNaseI中的任意一种或至少两种的组合。在一些实施方案中，所述核酸内切酶在所述酶反应液中的终浓度为0.003～0.05U/μL，例如可以是0.003U/μL、0.004U/μL、0.005U/μL、0.006U/μL、0.007U/μL、0.008U/μL、0.009U/μL、0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL，优选为0.004～0.03U/μL，进一步优选为0.005～0.01U/μL。在一些实施方案中，当所述核酸内切酶为Vvn时，所述核酸内切酶Vvn在所述酶反应液中的终浓度为0.1～0.5ng/μL，例如可以是0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.3ng/μL、0.4ng/μL或0.5ng/μL。本专利技术针对不同种类的核酸内切酶，通过优化核酸内切酶在反应体系中的浓度、控制核酸内切酶的用量，从而调节核酸内切酶对核酸的切割速率。本专利技术采用DNA聚合酶对已切割的核酸进行末端修复或在已切割核酸的3’端进行加A尾反应，所述DNA聚合酶包括低温DNA聚合酶和/或耐热DNA聚合酶，所述低温DNA聚合酶例如可以是来源于T4噬菌体的DNA聚合酶、来源于T7噬菌体的DNA聚合酶、来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I或来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I大片段Klenow中的任意一种或至少两种的组合，对已切割的核酸进行末端修复，所述耐热DNA聚合酶例如可以是TaqDNA聚合酶，在已切割核酸的3’端进行加A尾反应，以便后续基于TA连接原理进行接头连接反应。本专利技术中，术语“耐热DNA聚合酶”可以是TaqDNA聚合酶，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90％，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60％，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40％，术语“低温DNA聚合酶”是相对于“耐热DNA聚合酶”而言，不具有耐热活性的DNA聚合酶。在一些实施方案中，所述低温DNA聚合酶在所述酶反应液中的终浓度为0.01～0.05U/μL，例如可以是0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL，优选为0.02～0.04U/μL。在一些实施方案中，所述耐热DNA聚合酶在所述酶反应液中的终浓度为0.03～1.2U/μL，例如可以是0.03U/μL、0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建测序文库的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包括酶组合物和反应缓冲液；/n所述酶组合物包括核酸内切酶、DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶；/n所述反应缓冲液包括金属盐、底物和缓冲介质水溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于构建测序文库的酶反应液，其特征在于，所述酶反应液包括酶组合物和反应缓冲液；
所述酶组合物包括核酸内切酶、DNA聚合酶和多聚核苷酸激酶；
所述反应缓冲液包括金属盐、底物和缓冲介质水溶液。


2.根据权利要求1所述的酶反应液，其特征在于，所述核酸内切酶包括核酸内切酶dsDNase、T7核酸内切酶、盐活性核酸内切酶SAN、核酸内切酶Vvn或核酸内切酶DNaseI中的任意一种或至少两种的组合。


3.根据权利要求1或2所述的酶反应液，其特征在于，所述DNA聚合酶包括低温DNA聚合酶和/或耐热DNA聚合酶；
优选地，所述低温DNA聚合酶包括T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、DNA聚合酶I或DNA聚合酶I大片段Klenow中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述耐热DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶。


4.根据权利要求1-3任一项所述的酶反应液，其特征在于，所述多聚核苷酸激酶包括T4多聚核苷酸激酶。


5.根据权利要求1-4任一项所述的酶反应液，其特征在于，所述酶组合物还包括辅助蛋白；
优选地，所述辅助蛋白包括牛血清白蛋白和/或单链结合蛋白；
优选地，所述单链结合蛋白包括大肠杆菌单链结合蛋白和/或T4噬菌体单链结合蛋白。


6.根据权利要求1-5任一项所述的酶反应液，其特征在于，所述金属盐包括金属阳离子，所述金属阳离子包括Mg2+、Mn2+、Na+或Ca2+中的任意一种或至少两种的组合。


7.根据权利要求1-6任一项所述的酶反应液，其特征在于，所述底物包括dNTPs、dATP或ATP中的任意一种或至少两种的组合。


8.根据权利要求1-7任一项所述的酶反应液，其特征在于，所述缓冲介质包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸和/或三羟甲基氨基甲烷。


9.根据权利要求1-8...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，聂俊伟，瞿志鹏，张力军，韩锦雄，江明扬，邱翠，
申请(专利权)人：江苏康科斯医疗科技有限公司，南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32