新型蛋白酶及其用途制造技术

本发明专利技术涉及新型蛋白酶，更具体地涉及与SEQ ID No:1的蛋白酶相比具有改进的活性的蛋白酶变体，及其用于降解含聚酯材料，诸如塑料制品的用途。本发明专利技术的蛋白酶特别适合于降解聚乳酸和含聚乳酸材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型蛋白酶及其用途
本专利技术涉及新型蛋白酶，更特别地涉及与亲本蛋白酶相比，具有改进的活性的蛋白酶，及其用于降解聚酯或含聚酯材料(诸如塑料制品)的用途。本专利技术的蛋白酶特别适用于降解乳酸和含聚乳酸材料。
技术介绍
蛋白酶能够催化多种聚合物(包括聚酯)的水解反应。在这方面，蛋白酶已在许多工业应用中显示出令人鼓舞的效果，包括作为用于洗碗和洗衣应用的洗涤剂、作为用于加工生物质和食品的降解酶、作为对环境污染物进行解毒的生物催化剂、或用于处理纺织工业中聚酯织物的蛋白酶。同样，蛋白酶作为用于水解乳酸(PLA)的降解酶的用途特别引人关注。实际上，PLA是可用于许多
的生物基聚合物(即衍生自天然和/或可再生资源的聚合物)，诸如柔性和刚性包装、袋、覆盖膜，以及用于制造衣服和地毯。因此，PLA在垃圾填埋场的积累成为日益严重的生态问题。在蛋白酶中，丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)是裂解蛋白质中肽酰胺键的酶，其中丝氨酸充当酶活性位点的亲核氨基酸。在真核生物和原核生物中均普遍发现丝氨酸蛋白酶。许多细菌丝氨酸蛋白酶最初是在芽孢杆菌中鉴定出的，后来在其他嗜温宿主中鉴定出。但是，已经有越来越多的丝氨酸蛋白酶从嗜热和超嗜热细菌被分离出。生物降解，更特别是酶降解，被认为是减少塑料废料积累的有意义的解决方案。实际上，酶能够加速含聚酯材料(更特别是塑料制品)的水解，甚至降解到单体水平。此外，可以将水解产物(即单体和低聚物)作为用于合成新聚合物的材料进行再回收。最近，已经开发出整合生物实体的新型塑料材料，该生物实体适于降解该塑料材料中的至少一种聚合物，从而制备出可生物降解塑料制品。例如，已经制备出由PLA制成并包括蛋白酶的塑料制品。该可生物降解的塑料至少可以部分解决塑料在垃圾填埋场和自然栖息地中积累的问题。对此，已经鉴定了几种蛋白酶为候选降解酶。例如，马杜拉放线菌属(Actinomadurasp.)的蛋白酶(WO2016/062695)已被描述了其降解聚酯(特别是聚乳酸)的能力。但是，仍然需要具有改进的活性的蛋白酶，以允许进行更高效的降解工艺，从而使生物可降解塑料制备工艺、生物聚酯降解工艺和/或生物循环工艺的竞争力提高。
技术实现思路
本专利技术提供了蛋白酶的新变体，其与亲本或野生型蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。这些蛋白酶在用于降解聚酯和/或含聚酯塑料材料和制品(诸如PLA或含聚乳酸(PLA)塑料材料和制品)的工艺中特别有效。更特别地，本专利技术提供了马杜拉放线菌属的蛋白酶的变体，该蛋白酶具有如SEQIDNo:1所示的氨基酸序列，其在本文中称为亲本蛋白酶或野生型蛋白酶。有趣的是，野生型蛋白酶和其变体都被认为是枯草杆菌蛋白酶样(subtilisin-like)蛋白酶。本专利技术进一步提供了使用本专利技术的变体降解聚酯和/或含聚酯塑料材料和制品(更特别是聚乳酸(PLA)和/或含PLA塑料材料和制品)的方法。在这方面，本专利技术的一个目的是提供蛋白酶变体，其(i)与SEQIDNo:1所示的全长氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，且(ii)具有在选自S101、S103、T106、G131、或G133的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQIDNo:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQIDNo:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。在一个具体实施方案中，该蛋白酶包含至少一种选自下组的取代：S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I、或G133K，优选地至少一种选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选地至少所述取代S101F。本专利技术的另一目的是提供蛋白酶变体，其(i)与SEQIDNo:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；且(ii)具有在选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I、或G133K的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQIDNo:1所示的氨基酸序列来编号，优选至少选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选至少所述取代S101F，且(iii)与SEQIDNo:1蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。本专利技术的另一目的是提供蛋白酶，其(i)与SEQIDNo:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)至少具有在位置S101和S103的氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQIDNo:1所示的氨基酸序列来编号，且(iii)与SEQIDNo:1蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。在此情况下，取代优选选自S101F/L/M/W/Y和S103L。更特别地，本专利技术提供特定蛋白酶，其与SEQIDNo:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且至少具有选自以下的取代的组合：S101F+S103L、S101F+T106I、T106I+G133K、S101F+S103L+T106I、S101F+S103L+G133K、S101F+T106I+G133K、S101F+S103L+T106L、S101F+S103L+T106I+G133K、S101F+S103L+T106I+G131I，优选S101F+S103L+T106I/L。本专利技术的另一目的是提供编码如上定义的蛋白酶的核酸。本专利技术还涉及包含所述核酸的表达盒或表达载体，并涉及包含所述核酸、表达盒、或载体的宿主细胞。本专利技术的另一目的是提供制备如上定义的蛋白酶的方法，其包括：(a)在适于表达编码所述蛋白酶的核酸的条件下，培养如上定义的宿主细胞；和任选地(b)从所述细胞培养物中回收所述蛋白酶。本专利技术还涉及降解含有至少一种聚酯(优选PLA)的塑料制品的方法，其包括：(a)使所述塑料制品与如上定义的蛋白酶或宿主细胞接触，从而降解所述塑料制品；和任选地(b)回收单体和/或低聚物，优选乳酸(LA)的单体和/或低聚物。本专利技术还涉及含聚酯材料，其包含根据本专利技术的蛋白酶或宿主细胞。更优选地，本专利技术涉及含聚乳酸(PLA)材料，其包含根据本专利技术的蛋白酶或宿主细胞或组合物。本专利技术还提供制备该含聚酯材料的方法，其包括将聚酯(优选PLA)与根据本专利技术的蛋白酶或宿主细胞或组合物混合的步骤，其中所述混合步骤在所述聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，优选在挤出工艺期间进行。本专利技术还涉及如上所述的蛋白酶用于降解含聚酯材料，更优选含PLA材料的用途。附图说明图1A&1B&1C显示了在45℃孵育5小时后，基于野生型蛋白酶(SEQIDNo:1–图1A)和本专利技术的蛋白酶(V8-图1B和V19-图1C)的固体形式的乳蛋白降解的比蛋白酶活性。具体实施方式定义参考以下定义，以最佳地理解本公开。在本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白酶，其(i)与SEQ ID No:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)具有在选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I、或G133K的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQ IDNo:1所示的氨基酸序列来编号，优选至少选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选至少所述取代S101F；且(iii)与SEQ ID No:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171221 EP 17306878.41.蛋白酶，其(i)与SEQIDNo:1所示的全长氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)具有在选自S101F/L/M/W/Y、S103L、T106I/L、G131I、或G133K的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQIDNo:1所示的氨基酸序列来编号，优选至少选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选至少所述取代S101F；且(iii)与SEQIDNo:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。


2.蛋白酶，其(i)与SEQIDNo:1所示的全长氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，且(ii)具有在选自S101、S103、T106、G131、或G133的位置的至少一种氨基酸取代，其中所述位置通过参考SEQIDNo:1所示的氨基酸序列来编号，优选至少选自S101F/L/M/W/Y的取代，更优选至少所述取代S101F；且(iii)与SEQIDNo:1的蛋白酶相比，表现出提高的聚酯降解活性。


3.根据权利要求2所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶包含在选自S101、S103、T106、G131或G133的位置的至少两种取代，优选至少三种取代。


4.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶至少包含选自S101F/L/M/W/Y+S103L+T106I/L的取代的组合。


5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶包含至少一种选自以下的取代的组合：S101F+S103L、S101F+T106I、T106I+G133K、S101F+S103L+T106I、S101F+S103L+G133K、S101F+T106I+G133K、S101F+S103L+T106L、S101F+S103L+T106I+G133K、S101F+S103L+T106I+G131I，优选S101F+S103L+T106I/L。


6.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白酶，其中与所述SEQIDNo:1的蛋白酶相比，在pH7-10下，优选在pH7.5和/或pH9下，所述蛋白酶表现出提高的聚酯降解活性。


7.核酸，其编码如权利要求1-6中任一项所定义的蛋白酶。

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【专利技术属性】
技术研发人员：A·马蒂，S·迪奎斯内，M·吉谢尔，M·盖鲁特，I·安德烈，
申请(专利权)人：卡比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR