一种高酶活的磷脂酶C突变体制造技术

本发明专利技术提供一种高酶活的磷脂酶C突变体，其序列如SEQ ID NO:7所示的多肽，或在SEQ ID NO:7所述的多肽中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：7所具备的磷脂酶C活性的由其衍生的多肽。本发明专利技术的磷脂酶C突变体能提高脱胶效率，增加脱胶过程中甘二酯(DAG)的得率。

【技术实现步骤摘要】
一种高酶活的磷脂酶C突变体
本专利技术涉及一种高酶活的磷脂酶C突变体。
技术介绍
脱胶是油脂精炼的一个重要步骤，而传统的水化脱胶法经济成本高，物料能耗大，环境污染重，所以近些年，很多努力致力于将酶法脱胶用于油脂精炼中的脱胶环节，并取得了很大的进展。同传统方法相比,酶法脱胶能够提高经济效益，做到节能减排，对生态环境污染少，在环保、经济、质量等方面具有较大的优势。油脂脱胶所用的酶即为磷脂酶，并且同其他脱胶酶相比，磷脂酶C(PLC)表现出更大的优势，比如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及减少得油量的损失。Bacilluscereus的PC-PLC(BC-PC-PLC)是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(Johansenetal.1988)。BC-PC-PLC的晶体结构已经被报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn2+结合位点(Houghetal.1989)。BC-PC-PLC的异源表达研究较少目前只在Bacillussubtilis和pichiapastoris中进行表达(Durbanetal.2007；Seoetal.2004)。在之前的研究中，专利技术人已经通过将BC-PC-PLC的四个氨基酸即56位，63位，131位和134位天冬酰胺分别突变为组氨酸，天冬氨酸，丝氨酸和天冬氨酸，比酶活相比于野生型大大提高。为了进一步提高该磷脂酶C的比酶活力和脱胶效率，专利技术人选择了BC-PC-PLC蛋白中第6位，第8位，第10位，第104位，第205位氨基酸进行随机饱和突变，对已有的磷脂酶C突变体进行定向进化，希望能够得到比酶活进一步提高的突变体，从而能够得到更高效的磷脂酶C，提高脱胶效率，增加脱胶过程中甘二酯(DAG)的得率。
技术实现思路
本专利技术提供一种分离的多肽，所述多肽选自：(1)SEQIDNO:7所示的多肽；和(2)与SEQIDNO:7至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，对应于SEQIDNO:7第6位、第8位、第10位和第104位中的至少1个位置的氨基酸残基分别相应地与SEQIDNO:7第6位、第8位、第10位和/或第104位相同，同时保留SEQIDNO：7所具备的磷脂酶C活性的多肽。在一个或多个实施方案中，SEQIDNO:7中，第6位氨基酸残基是脯氨酸或色氨酸；第8位氨基酸残基是丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；第10位和第104位氨基酸各自独立为丝氨酸或苏氨酸。在一个或多个实施方案中，所述分离的多肽如SEQIDNO:4所示。本专利技术还提供一种分离的多肽，所述多肽与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且所述分离多肽在对应于SEQIDNO:4第6、8、10和104位上的氨基酸残基分别是脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸和丝氨酸；优选的，所述多肽获自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。本专利技术还提供一种多核苷酸序列，选自：(1)编码本文任一实施方案所述多肽的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和(3)(1)或(2)所述序列的长15-30个碱基的片段；优选地，所述多核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含本文任一实施方案所述的多核苷酸序列和一条或多条与该多核苷酸序列操作性连接的调控序列。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体为载体。在一个或多个实施方案中，所述载体为表达载体或克隆载体。本专利技术还提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本文任一实施方案所述的多核苷酸序列或核酸构建体。本专利技术还提供一种组合物，所述组合物含有本文任一实施方案所述的多肽和任选的辅料，优选地，所述辅料为选自活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。本专利技术还提供本文任一实施方案所述的多肽、多核苷酸序列、核酸构建体、宿主细胞或组合物在油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业中的应用。本专利技术还提供一种酶法脱胶方法，所述方法包括使用本文任一实施方案所述的多肽进行脱胶，优选的，所述方法包括将所述多肽与毛油接触的步骤，优选的，所述步骤包括将所述多肽与50-70℃毛油接触。在一个或多个实施方案中，所述方法包括以下特征中的一项或多项：(1)以毛油重量计，所述多肽的添加量为10～1000ppm，优选为50～500ppm，更优选为100～300ppm；(2)所述脱胶包括：在50～60℃下搅拌1～3小时，然后升温至80～90℃保持1～10分钟；和(3)所述毛油选自：大豆油、葵花籽油、花生油、菜籽油、米糠油、玉米油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈软脂、卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、红花油、山茶花油、妥尔油和椿油。附图说明图1：突变体的比酶活。图2：脱胶小试结果。图3：磷脂酶活力测定标准曲线。具体实施方式应理解，在本专利技术范围中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。本专利技术提供氨基酸序列如SEQIDNO：7所示的分离的多肽，或与SEQIDNO:7至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且对应于SEQIDNO:7第6位、第8位、第10位和第104位中的至少1个位置的氨基酸残基分别相应地与SEQIDNO:7第6位、第8位、第10位和/或第104位相同，同时保留SEQIDNO：7所具备的磷脂酶C活性的多肽。本文中，“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或物质。分离的物质的非限制性例子包括任何非天然存在的物质和至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子。SEQIDNO:7中，第6位和第8位氨基酸残基(Xaa)可以是具有非极性侧链的氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；第10位和第104位氨基酸残基(Xaa)可以是具有不带电荷的极性侧链的氨基酸，包括但不限于甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸。优选地，SEQIDNO:7中，第6位氨基酸残基是脯氨酸或色氨酸；第8位氨基酸残基是丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；第10位和第104位氨基酸各自独立为丝氨酸或苏氨酸。示例性的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术还包括在SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自：/n(1)SEQ ID NO:7所示的多肽；和/n(2)与SEQ ID NO:7具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且对应于SEQ ID NO:7第6位、第8位、第10位和第104位中的至少1个位置的氨基酸残基分别相应地与SEQ ID NO:7第6位、第8位、第10位和/或第104位相同，同时保留SEQ ID NO：7所具备的磷脂酶C活性的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自：
(1)SEQIDNO:7所示的多肽；和
(2)与SEQIDNO:7具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且对应于SEQIDNO:7第6位、第8位、第10位和第104位中的至少1个位置的氨基酸残基分别相应地与SEQIDNO:7第6位、第8位、第10位和/或第104位相同，同时保留SEQIDNO：7所具备的磷脂酶C活性的多肽。


2.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，SEQIDNO:7中，第6位氨基酸残基是脯氨酸或色氨酸；第8位氨基酸残基是丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；第10位和第104位氨基酸各自独立为丝氨酸或苏氨酸；优选地，所述分离的多肽如SEQIDNO:4所示。


3.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且所述分离多肽在对应于SEQIDNO:4第6、8、10和104位上的氨基酸残基分别是脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸和丝氨酸；优选的，所述多肽获自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。


4.一种多核苷酸序列，选自：
(1)编码权利要求1-3中任一项所述多肽的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和
(3)(1)或(2)所述序列的长15－30个碱基的片段；
优选地，所述多核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


5.一种核酸构建体，其特征在于，该核酸构建体包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣姚吉，牛其文，徐正军，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31