一种提升磷脂酶C热稳定性的方法技术

本发明专利技术提供一种提升磷脂酶C热稳定性的方法。本发明专利技术提供的方法将磷脂酶C浓缩液于50‑70℃孵育10‑40min；所述热稳定性为磷脂酶C于37℃保藏时的稳定性。本发明专利技术的方法可提升磷脂酶C在37℃保藏时的稳定性。

A method to improve the thermal stability of phospholipase C

【技术实现步骤摘要】
一种提升磷脂酶C热稳定性的方法
本专利技术涉及磷脂酶C储藏，具体涉及提升磷脂酶C储藏时的热稳定性的方法。
技术介绍
磷脂酶具备水解一个或多个甘油磷脂酯键的能力，它代表着一类脂肪酶、酰基水解酶和磷酸酯酶。磷脂酶根据该酶在磷脂分子上作用位点的不同，可以分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。其中，磷脂酶C(PhospholipaseC，简称PLC)，是一种能够水解甘油磷脂C3位点磷脂酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂类水解酶。磷脂酶C广泛存在于动植物和微生物中，动植物来源PLC一般位于细胞膜上，结构较为复杂，属于内源性磷脂酶C，难以分离。微生物来源的磷脂酶C结构一般较为简单，这些酶已经从各种微生物中分离得到，细菌来源的较多包括产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens[1]、双酶梭菌C.bifermentans、Burkholderiapseudomallei、Bacilluscereus、蕈状芽孢杆菌Bacillusmycoiddes、苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis、单核细胞增多性李斯特氏菌Listeriamonocytogenes、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、荧光假单胞菌P.fluorescens、葡萄球菌Straphylococusaureus、鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii、链霉菌Streptomycesclavuligerus、伯克氏菌属Burkholderi等等。来自放线菌的有八丈岛链霉菌Streptomyceshachijyoensis等。还有来自酵母菌的白色念珠菌Candiaalbicans[2]、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae[3]等。目前，磷脂酶C主要应用于酶法脱胶。在制造大豆、菜籽等食用油时，未经精炼的毛油主要含有甘油三酯、磷脂、甾醇、生育酚、游离脂肪酸、痕量金属以及其它微量化合物的复杂混合物。其中磷脂会造成色泽及口味变差、保质期变短并且影响后续的精炼效果。目前，主要的脱胶方式有水化脱胶、深度脱胶和酶法脱胶。酶法脱胶由于条件温和、无污染、油耗低，越来越受到人们的青睐。由于磷脂酶C作用于甘油磷脂可以生成甘油二酯，因此，在酶法脱胶过程中使用磷脂酶C可以显著提升油脂的得率，从而提高生产经济效益。酶制剂一般要求在4℃条件下保藏，但在酶法脱胶的实际应用中，磷脂酶C常被置于单独的储罐中备用，由于环境温度较高，容易导致磷脂酶C的活力损失。因此，提高磷脂酶C的热稳定性就具有非常重要的生产实践意义。参考文献[1]YunT,SiebelC.CloningandexpressionofthePLCgenefromClostridiumperfringensandClostridiumbifermentants[J].Infectionandimmunity,1989,2:468-476.[2]AnaluzE,Juan-JoseR,RosarioCueva.Sequencingofa4.3kbpregionofchromosome2ofCandidaalbicansrevealsthepresenceofhomologuesofSHE9fromSaccharomycescerevisiaeandofbacterialphosphatidylinostiol-phospholipaseC[J].Yeast,2001,18(8):711-721.[3]PayneW,Fitzgerald-HayesM.AmutationinPLC1,acandidatephosphoinositidespecificphospholipaseCgenefromSaccharomycescerevisiae,causesaberrantmitoticchromosomesegregation[J].MolecularandCellularBiology,1993,13:4351-4364.
技术实现思路
本专利技术提供了一种提升磷脂酶C热稳定性的方法，所述热稳定性为磷脂酶C于37℃保藏时的稳定性。本专利技术提供的方法包括：将磷脂酶C浓缩液于50-70℃孵育10-40min。在本专利技术的一个或多个优选方案中，该方法包括将磷脂酶C浓缩液于60-70℃孵育10-40min。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C浓缩液为磷脂酶C发酵液和/或发酵上清液的浓缩液。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C浓缩液通过硫酸铵沉淀蛋白后复溶或有机溶剂沉淀蛋白后复溶制备。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C浓缩液通过以下方法制备：A)用超滤膜对磷脂酶C的微滤清液进行超滤浓缩，获得磷脂酶C的超滤浓缩液；B)使用pH5.0-7.0的缓冲液对步骤A)的超滤浓缩液进行透析置换，获得磷脂酶C浓缩液。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述缓冲液为：10-100mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述超滤浓缩为使用截留分子量为1-10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C的微滤清液为用微滤膜将磷脂酶C发酵液或发酵上清液进行微滤获得，所述磷脂酶C发酵上清液为将磷脂酶C发酵液离心分离获得。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述微滤为使用孔径为50-500nm的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述方法还包括向孵育后的磷脂酶C浓缩液中加入多羟基化合物和防腐剂的步骤。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述多羟基化合物为山梨醇和/或甘油；在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述防腐剂为山梨酸钾和/或苯甲酸钠。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述磷脂酶C为来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酶C。本专利技术还提供了一种制备磷脂酶C制剂的方法。本专利技术提供的方法包括以下步骤：a)磷脂酶C发酵液离心，收集上清液；b)将步骤a)的上清液进行微滤，获得微滤清液；c)将步骤b)的微滤清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；d)将步骤c)的超滤浓缩液进行透析置换，获得磷脂酶C浓缩液；e)向孵育后的磷脂酶C浓缩液中加入多羟基化合物和防腐剂的步骤。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述离心为于6000-12000g下离心15-45min。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述微滤用孔径为50-500nm的微滤膜对发酵离心上清液进行微滤。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述超滤浓缩为使用截留分子量为1-10KDa的超滤膜对微滤清液进行超滤浓缩。在本专利技术的一个或多个优选方案中，所述透析置换为使用pH5.0-7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提升磷脂酶C热稳定性的方法，其特征在于，将磷脂酶C浓缩液于50-70℃孵育10-40min；优选于60-70℃孵育10-40min；所述热稳定性为磷脂酶C于37℃保藏时的稳定性。/n

【技术特征摘要】
1.一种提升磷脂酶C热稳定性的方法，其特征在于，将磷脂酶C浓缩液于50-70℃孵育10-40min；优选于60-70℃孵育10-40min；所述热稳定性为磷脂酶C于37℃保藏时的稳定性。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C浓缩液为磷脂酶C发酵液的浓缩液和/或发酵上清液的浓缩液。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C浓缩液通过硫酸铵沉淀蛋白后复溶或有机溶剂沉淀蛋白后复溶制备或通过以下方法制备：
A)用超滤膜对磷脂酶C的微滤清液进行超滤浓缩，获得磷脂酶C的超滤浓缩液；
B)使用pH5.0-7.0的缓冲液对步骤A)的超滤浓缩液进行透析置换，获得磷脂酶C浓缩液；所述缓冲液优选为：10-100mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶C的微滤清液为用微滤膜将磷脂酶C发酵液或发酵上清液进行微滤获得，所述磷脂酶C发酵上清液为将磷脂酶C发酵液离心分离获得。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向孵育后的磷脂酶C浓缩液中加入多羟基化合物和防腐剂的步骤，所述多羟基化合物优选为山梨醇和/或甘油，所述防腐剂优选为山梨酸钾和/或苯甲酸钠。


6.一种制备磷脂酶C制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)磷脂酶C发酵液离心，收集上清液；所述离心优选为于6000-12000g下离心15-45min；
b)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾思天，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31