一种耐热磷脂酶D突变体及其制备和合成功能磷脂的方法技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种热稳定性能提升的磷脂酶D突变体及其制备与应用。通过分子生物学技术手段获得郝氏链霉菌(Streptomyces halstedii)野生型的磷脂酶D基因，利用易错PCR技术对野生型磷脂酶D基因进行随机突变，得到磷脂酶D突变体S163F，及其编码基因pldm，重新构建重组质粒，并实现了其在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得热稳定性进一步提高的磷脂酶D。

【技术实现步骤摘要】
一种耐热磷脂酶D突变体及其制备和合成功能磷脂的方法
：本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及一种热稳定性能提升的磷脂酶D突变体及其制备与应用。
技术介绍
：磷脂酶D(PhospholipaseD,PLD,EC3.1.4.4)，是一种能作用于磷酰氧键的酶，不仅能水解磷脂头部末端的磷酯键生成磷脂酸和羟基化合物，还可以催化一些含羟基的化合物结合到磷脂的酰基上，形成新的磷脂，这一特性称为PLD的转磷酯化反应，也称碱基交换反应。磷脂广泛分布于动植物界，是一种天然的生物表面活性剂，也是人类及动植物组织细胞膜的重要组成成分，具有良好的乳化性和抗氧化性；同时作为细胞膜的重要组成部分还具有调节血脂，降低胆固醇；强化脑部功能，增强记忆力；延缓衰老等重要的生理功能。因此，可以利用PLD对磷脂进行改性，制备单一或稀有磷脂，如磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。这些酶改性磷脂在营养价值，各种性能等方面大为改进和提高，被广泛地应用于食品、保健品、医药、饲料、化妆品等领域。目前，PLD已在植物、动物及微生物中相继发现。与动植物来源的PLD相比，微生物来源的PLD易于分离、提取及生产，具有较强的底物耐受性，较宽广的底物专一性和较高的转酯活性，因而备受关注。目前已报道的产PLD的微生物主要有链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏杆菌属(Salmonella)等。其中，链霉菌属来源的PLD表现出较强的转酯能力以及更为广泛的底物选择谱，因此，对其研究最为广泛。目前，常见的磷脂制备工艺主要有有机溶剂萃取法和超临界CO2萃取法。有机溶剂萃取法生产纯度低、存在有机溶剂残留等安全隐患；超临界CO2萃取法存在生产成本高，工业化难度大等问题。与之相比，利用PLD生物催化制备自然界稀少、难以分离提纯的单一磷脂及磷脂衍生物，具有绿色环保、反应条件温和，成本低廉，规模化生产简单等优点。PLD的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和pH值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质。其中热稳定性是酶的一个重要性质，具有以下优点：活力稳定；能降低微生物污染的概率；对化学变性剂具有较好的抵抗力；加快动力学反应；在较高温度下，增加底物溶解度和利用率；降低工业成本等。因此，酶的热稳定性研究具有重要意义，有助于扩展酶在食品、医药、饲料等领域的应用。然而，目前大多数PLD维持其正常活性的条件温和，而实际应用中高热、高酸、高盐等环境不可避免，从而导致酶的热稳定性差、效率低和特异性差等，这不仅限制了其应用范围，还增加了工业应用成本，为实际应用带来困难。因此，筛选到热稳定性能好的PLD及其编码基因，具有重要研究意义。为了解决这些实际应用问题，研究者通过蛋白质工程技术来改善天然酶的功能及特征，以满足工业上的应用，例如定向进化、理性设计、化学修饰等。定向进化是改善蛋白质功能和活性的重要手段之一，尤其在提高蛋白质热稳定性方面。它属于蛋白质的非理性设计，不需要获得蛋白的高级结构以及催化位点等结构，只需对蛋白氨基酸序列做随机突变。它可以在实验室里模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合人类应用价值的蛋白突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、饱和突变、DNA改组、交错延伸PCR等。定点突变，即理性设计，在蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等基础上，有的放矢对其进行改造，且只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，对酶功能的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。芽孢杆菌表达系统作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。
技术实现思路
：基于现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种热稳定性能提升的新型PLD及其制备与应用。实现本专利技术目的的技术路线概述如下：通过基本的分子生物学技术手段获得郝氏链霉菌(Streptomyceshalstedii)野生型PLD基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型pld序列(如SEQIDNO.2所示)，利用易错PCR技术对野生型PLD基因进行随机突变，利用枯草芽孢杆菌表达系统筛选得到PLD突变体S163F，及其编码基因pldm，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得热稳定性能提高的PLD突变体。在本专利技术中采用如下定义：1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2.PLD突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示PLD突变体中突变的氨基酸。如Ser163Phe，表示位置163的氨基酸由野生型PLD的Ser替换成Phe，位置的编号对应于SEQIDNo.1中野生型PLD的氨基酸序列编号。在本专利技术中，小写斜体pld表示野生型PLD的编码基因，小写斜体pldm表示突变体S163F的编码基因，信息如下表。PLD氨基酸突变位点基因突变位点氨基酸SEQIDNo.核苷酸SEQIDNo.野生型——12S163FSer163PheTCC→TTC34所述的PLD突变体及其编码基因的表达载体为pBSA43，宿主细胞可以为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.11218或地衣芽孢杆菌TCCC11965。本专利技术的实验方案具体如下：1、所述热稳定性能提升的PLD突变体编码基因的获得，包括如下步骤：(1)以郝氏链霉菌野生型PLD编码基因pld(SEQIDNo.2)为模板进行易错PCR随机突变野生型PLD编码基因；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶D突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.3所示。


2.权利要求1所述磷脂酶D突变体的编码基因。


3.权利要求2所述磷脂酶D突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQIDNo.4所示。


4.一种包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，路福平，马杰莹，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12