具有磷脂酶C活性的多肽及其用途制造技术

本申请提供了具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽具有1)包含在一个或多个位置发生氨基酸取代的SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，其中所述一个或多个位置选自SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位或其任意组合；或2)与1)至少80％序列同一性，且第6位、第8位、第10位、第104位、第205位的至少1个位置与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位不同。本申请还提供了编码所述多肽的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的细胞。本申请还提供了所述多肽、核酸分子载体以及细胞的用途。

【技术实现步骤摘要】
具有磷脂酶C活性的多肽及其用途
本申请提供了具有磷脂酶C活性的多肽及其用途。
技术介绍
脱胶是油脂精炼的重要步骤，传统的水化脱胶法经济成本高，物料能耗大，环境污染重，所以近些年来，很多工作致力于将酶法脱胶用于油脂精炼中的脱胶环节。同传统方法相比，酶法脱胶能够提高经济效益，实现节能减排，对生态环境污染少，在环保、经济、质量等方面具有较大的优势。油脂脱胶中所用的一种酶为磷脂酶。同其他脱胶酶相比，磷脂酶C(PLC)表现出更大的优势，例如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及减少得油量的损失。蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(BC-PC-PLC)是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(参见，例如Johansen,T.,Holm,T.,Guddal,P.H.,Sletten,K.,Haugli,F.B.,Little,C.(1988)."Cloningandsequencingofthegeneencodingthephosphatidylcholine-preferringphospholipaseCofBacilluscereus."Gene65(2):293-304)。先前有文献报道，野生型BC-PC-PLC的活性位点为Glu4、Asp55、Tyr56、Glu146、Ser64、Thr65、Phe66、Phe70、Ile80、Thr133、Asn134、Leu135、Ser143(参见，例如Hough.,E.,Hansen,L.K.,Birknes,B.,Jynge,K.,Hansen,S.,Hordvik,A.,Little,C.,Dodson,E.,Derewenda,Z.(1989)"High-resolution(1.5A)crystalstructureofphospholipaseCfromBacilluscereus."Nature.338:357-60)。BC-PC-PLC的晶体结构已有报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn2+结合位点(参见，例如Hough.,E.,Hansen,L.K.,Birknes,B.,Jynge,K.,Hansen,S.,Hordvik,A.,Little,C.,Dodson,E.,Derewenda,Z.(1989)"High-resolution(1.5A)crystalstructureofphospholipaseCfromBacilluscereus."Nature.338:357-60)。BC-PC-PLC的异源表达研究较少，已有报道涉及在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和毕赤酵母(pichiapastoris)中表达BC-PC-PLC(参见，例如Durban,M.A.,Silbersack,J.,Schweder,T.,Schauer,F.,Bornscheuer,U.T.(2007)HighlevelexpressionofarecombinantphospholipaseCfromBacilluscereusinBacillussubtilis.ApplMicrobiolBiotechnol74(3):634-639；以及Seo,K.H,RheeJ.I.(2004)High-levelexpressionofrecombinantphospholipaseCfromBacilluscereusinPichiapastorisanditscharacterization.BiotechnolLett26(19):1475-1479)。但现有报道的磷脂酶C的热稳定性不高，不能耐受超过60℃，使其最适的脱胶温度需要控制在50℃，因而使其在工业应用中具有一定的局限性。如能有效提高磷脂酶C的热稳定性，有利于磷脂酶C的工业应用，具体包括：首先脱胶时将温度提高，有利于降低油的粘度，提高油脂和磷脂的分离程度，减少磷脂中夹带的油脂，进一步提高油脂的得率；其次目前有采用PLC与PLA1联合使用进行深度脱胶，专利技术专利CN201480017114.5中就提到了一种新的PLA1其最适的脱胶温度在65℃，因此更耐热的PLC有利于与PLA1进行联合脱胶，另外，有时毛油在储藏过程中特别是在高温天气，毛油的温度会超过50℃，因此如果PLC的最适反应温度低于50℃还需要大量冷水进行对毛油降温，产生大量能耗。因此，开发新的具有耐热性能的磷脂酶C活性的多肽对于本领域具有重要实用和经济价值。专利技术概述第一方面，本申请提供了具有磷脂酶C活性的多肽，所述多肽具有1)包含在一个或多个位置发生氨基酸取代的SEQIDNo:2所示的氨基酸序列，其中所述一个或多个位置选自SEQIDNo:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位或其任意组合；或2)与1)至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且第6位、第8位、第10位、第104位、第205位的至少1个位置与SEQIDNo:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位不同。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位和第205位全部发生氨基酸取代。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第6位的氨基酸取代为脯氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代赖氨酸。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第6位的赖氨酸被脯氨酸取代。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第8位的氨基酸取代为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或正亮氨酸取代赖氨酸。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第8位的赖氨酸被异亮氨酸取代。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第10位的氨基酸取代为苏氨酸或丝氨酸取代甘氨酸。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第10位的甘氨酸被苏氨酸取代。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第104位的氨基酸取代为甘氨酸或脯氨酸取代赖氨酸。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第104位的赖氨酸被甘氨酸取代。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第205位的氨基酸取代为酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、或苏氨酸取代丝氨酸。在一些实施方案中，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第205位的丝氨酸被酪氨酸取代。在一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列包含如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽的氨基酸序列由如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列组成。第二方面，本申请提供了一种分离的多肽，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有磷脂酶C活性的多肽，所述多肽具有：/n1)包含在一个或多个位置发生氨基酸取代的SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，其中所述一个或多个位置选自SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位或其任意组合；优选地，SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位和第205位全部发生氨基酸取代；或/n2)与1)至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且第6位、第8位、第10位、第104位、第205位的至少1个位置与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位不同。/n

【技术特征摘要】
1.具有磷脂酶C活性的多肽，所述多肽具有：
1)包含在一个或多个位置发生氨基酸取代的SEQIDNo:2所示的氨基酸序列，其中所述一个或多个位置选自SEQIDNo:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位或其任意组合；优选地，SEQIDNo:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位和第205位全部发生氨基酸取代；或
2)与1)至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，且第6位、第8位、第10位、第104位、第205位的至少1个位置与SEQIDNo:2所示的氨基酸序列中第6位、第8位、第10位、第104位、第205位不同。


2.如权利要求1所述的多肽，其中
SEQIDNo:2所示的氨基酸序列的第6位的氨基酸取代为脯氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代赖氨酸，优选脯氨酸取代赖氨酸，和/或
第8位的氨基酸取代为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸或正亮氨酸取代赖氨酸，优选异亮氨酸取代赖氨酸，和/或
第10位的氨基酸取代为苏氨酸或丝氨酸取代甘氨酸，优选苏氨酸取代甘氨酸，和/或
第104位的氨基酸取代为甘氨酸或脯氨酸取代赖氨酸，优选甘氨酸取代赖氨酸，和/或
第205位的氨基酸取代为酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、或苏氨酸取代丝氨酸，优选酪氨酸取代丝氨酸；
优选地，所述多肽的氨基酸序列包含如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列或由如SEQIDNo:4所示的氨基酸序列组成。


3.分离的多肽，其中，所述多肽与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的序列同一性，并且所述分离的多肽在对应于SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣姚吉，牛其文，徐正军，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31