碱性磷酸酶的下游处理制造技术

本发明专利技术涉及碱性磷酸酶(AP)的下游处理(DSP)领域。更具体地，本发明专利技术涉及减少包含AP的组合物中宿主细胞蛋白含量的方法。本发明专利技术进一步涉及包含AP和减少含量的宿主细胞蛋白的组合物。

【技术实现步骤摘要】
碱性磷酸酶的下游处理分案说明本申请为申请日为2015年1月26日，申请号为201580015952.3，题目为“碱性磷酸酶的下游处理”的专利申请的分案申请。
本专利技术涉及碱性磷酸酶(AP)的下游处理(DSP)领域。更具体地，本专利技术涉及用于降低包含AP的组合物中宿主细胞蛋白含量的方法。本专利技术进一步涉及包含AP和降低含量的宿主细胞蛋白的组合物。
技术介绍
碱性磷酸酶(AP)AP；根据IUBMB酶命名法EC3.1.3.1，常用名为碱性磷酸酶(AP)是一种将磷酸酶单酯和H2O催化成为醇和磷酸盐的反应的酶。AP的其他名称为碱性磷酸单酯酶；磷酸单酯酶；甘油磷酸酶；碱性磷酸水解酶；碱性苯基磷酸酶；正磷酸单酯磷酸水解酶(碱性最佳)。AP的系统命名为磷酸单酯磷酸水解酶(碱性最佳)。AP是一种广谱特异性酶，其也催化转磷酸作用。在人类和其他哺乳动物中，已知存在至少四种不同的，但相关的碱性磷酸酶。其为肠(ALPI)、胎盘(ALPP；仅在人和灵长目动物中)、胎盘样(GCAP)和肝/骨/肾(或组织非特异性)碱性磷酸酶(TNAP)。前三种一起位于染色体2上，而组织非特异性形式位于染色体1上。碱性磷酸酶的氨基酸序列以及催化结构域和冠状结构域的相对位置是本领域技术人员公知的。例如，可参照Millán的关于哺乳动物碱性磷酸酶的教科书(MammalianAlkalinePhosphatases,Wiley-VCH(2006),ISBN-13：978-3-527-31079-1)，其中示出了四种人碱性磷酸酶的氨基酸序列等。用于药物用途的AP之前已经显示AP作为许多疾病的药物是有益的(急性肾损伤(AKI)、败血症、炎性肠病(IBD)等)。这些研究使用天然存在的AP，例如分离的牛AP以及分离和重组人AP。在一些动物模型中，已经使用了重组嵌合的碱性磷酸酶，其包括人肠AP的催化结构域和人胎盘AP的冠状结构域(描述在WO2008133511中)。目前，包含具有图18中所示序列(SEQIDNO：1)的新型和改善的重组嵌合的碱性磷酸酶的药物组合物正在被开发用作药物。在药物组合物的开发过程中，使用蛋白质并且尤其是AP的标准(DSP)方法，例如亲和色谱(MimeticBlue)、阴离子交换色谱(Poros50)以及混合模式色谱(Capto-)。在优化DSP步骤之后并且药物组合物符合之前监管当局设定和要求的规格之后，制备用于临床批次生产的制剂。然而，在最后阶段稳定性测试期间，观察到了颗粒形成。这是一个无法预见的问题，而由于颗粒形成是药物组合物中有害的方面，必须找到解决方案。不清楚颗粒的性质如何，并且通过离心收集颗粒和分析之后，在银染色的非还原性SDS-PAGE凝胶中富集了非AP条带。该条带的酶促消化的质谱分析揭示了存在宿主细胞蛋白(HCP)而不是AP。这是尤其不可预见的，因为根据之前对宿主细胞蛋白进行的测试，组合物中如此少量的HCP(<100ppm)无法解释相对大量的颗粒。宿主细胞蛋白(HCP)HCP是由生产过程中使用的细胞或生物体产生或编码，并且与期望的产物不相关的蛋白。一些HCP对于生长、存活和正常细胞加工是必需的，而其他的HCP可能不是必需的。就像期望的产物，HCP也可以通过宿主由一些翻译后修饰而被修饰。无论HCP的用途如何或是否缺少，在最终的药物物质中通常不希望有HCP。虽然通常以少量存在(百万分之一，表示为纳克/毫克期望的蛋白)，但是工业上花费了更多的努力和成本以将其去除(Wang等人；BiotechnologyandBioengineering,Vol.103,No.3,June15,2009)。根据美国食品和药品管理局的“考虑要点(PointstoConsider)”文件和欧盟的“指导说明(NotesforGuidance)”，在批准用于治疗用途的生物产品之前，必须对产品中残留HCP的水平进行定量测量。因此，在DSP期间，通常消除HCP并且必须证实消除。目前用于分析重组生物产品中污染物HCP的分析方法包括SDS-PAGE、免疫印记技术和ELISA。还有有关除去HCP污染以及利用例如疏水相互作用色谱(Shukla等人,Biotechnol.Prog.2002,18,556-564)、蛋白质A色谱(Shukla等人,Biotechnol.Prog.2008,24,11151121)或耐盐阴离子交换配体(Riordan等人,Biotechnol.Prog.2009,Vol.25,No.6)除去的出版物。因此，需要优化的DSP和制剂以提供包含具有降低的HCP含量和改善的物理稳定性的碱性磷酸酶的药物组合物。本专利技术的专利技术人已经采用了DSP和最终药物制剂，从而a)降低HCP的含量和b)减少观察到的颗粒形成。采用DSP的主要目的是降低HCP的含量，而采用制剂的主要目的是减少由于任何残留HCP造成的(可见)颗粒的形成。采用DSP和采用制剂在稳定性测试期间协同减少了颗粒形成，因此改善了药物组合物的物理稳定性。至少当组合时，改善的DSP和新剂型得到药物组合物，其中该组合物具有降低的HCP含量并且其中在稳定性测试期间无可见颗粒形成。在第一个实施方式中，本专利技术提供了用于产生包含分离的碱性磷酸酶和降低含量的宿主细胞蛋白(HCP)，优选少于100ppm的HCP的组合物的方法，该方法包括第一纯化步骤，该第一纯化步骤由以下步骤组成：-提供包含具有下式配体的固相：其中R表示将配体与固相连接的间隔分子，-使所述配体与包含与SEQIDNO:1具有至少90％序列同一性的分离的AP和HCP的组合物接触；-实施数个洗涤步骤，其中至少一个洗涤步骤是利用洗涤缓冲液进行的，所述洗涤缓冲液能够将至少部分HCP与配体分离同时保持至少部分AP与配体结合，和-利用能够将至少部分所述AP与配体分离的洗脱缓冲液获得AP。优选地，当进行该最后步骤时，至少部分HCP保持与配体结合或在固相上。氨基酸或核酸序列的同一性百分比，或术语“％序列同一性”在本文中被定义为在必要时为了实现最大百分比同一性，在两个序列进行比对并引入缺口之后，候选氨基酸或核酸序列中的残基与参比序列中残基相同的百分比。在优选的实施方式中，所述至少百分比序列同一性的计算是在不引入缺口的情况下进行的。用于比对的方法和计算机程序是本领域已知的，例如，“Align2”或国家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)提供的BLAST服务。DSP包括涉及亲和纯化的纯化步骤，其利用具有下式的针对碱性磷酸酶的已知配体：其中R为反应性基团或与固相连接的间隔分子，其中，洗涤步骤已被优化以达到高纯度并且产生降低的HCP含量，从而使所得包含AP的组合物的物理稳定性最优。柱形式的式(I)的配体可以商标名MimeticBlueAPTM(MMBAP；Prometic,UK)商购获得，其中R为间隔分子，其用于产生柱子的固相基质和配体之间的距离。该距离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含分离的碱性磷酸酶的组合物，其特征在于所述组合物包含少于100ppm的宿主细胞蛋白，并且其中所述组合物在2-8℃下持续2个月的稳定性测试过程中，不显示出可见的颗粒形成。/n

【技术特征摘要】
20140124 EP 14152542.81.包含分离的碱性磷酸酶的组合物，其特征在于所述组合物包含少于100ppm的宿主细胞蛋白，并且其中所述组合物在2-8℃下持续2个月的稳定性测试过程中，不显示出可见的颗粒形成。


2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：路易吉·约翰内森·科尼利厄斯·琼克，斯蒂芬·爱德华·康纳，埃瑞克·简·范·德·伯格，安德里亚·范·埃尔萨斯，阿比纳夫·阿洛克·舒克拉，希瑟·贝西娅·霍纳，苏珊·库克，蒂莫西·马丁·凯利，维多利亚·安妮·道林，米亚利·方亚马拉拉·拉马鲁松，
申请(专利权)人：安法玛公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL