一种酯水解酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及一种酯水解酶突变体,属于蛋白质工程技术领域。以酵母分泌表达获得的酯水解酶突变体作为生物催化剂，对高浓度底物3‑异丁基‑戊二酸二酯进行立体选择性水解，获得的手性产物(S)‑3‑异丁基‑戊二酸单酯的手性纯度大于98％，转化率达到100％。经过后期提取分离，收率达到97％，大幅度提高了合成效率，降低了生产成本，适合工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种酯水解酶突变体
：本专利技术属于蛋白质工程
，具体涉及一种高立体选择性的酯水解酶突变体。
技术介绍
：普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB)，商品名为乐瑞卡(Lyricca)，化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是美国辉瑞(Pfizer)研制的一种γ-氨基丁酸类似物，是一种手性分子，S构型疗效高，主要用于治疗癫痫、广泛性焦虑症及糖尿病和疱疹后的神经痛。该药上市后反应良好，具有药效强、不良反应小、服用次数少等优点，受到全球各医药公司的高度关注。目前，市场上的普瑞巴林药物仍以化学法合成为主，主要使用手性拆分试剂进行化学拆分，或使用不对称催化剂、手性配体进行不对称合成。这些方法需要苛刻的高温高压等极端反应条件，同时伴随着副产物多、收率低、污染环境等缺点。随着生物技术的发展，特别是生物酶催化技术在化学合成中的应用，使得一些难合成的手性分子，在酶的参与下变的非常容易，这也吸引了大量的科学人员对该领域进行深入研究。美国专利US2005/0283023中报道使用96孔板筛选可选择性水解(R/S)-2-羰乙基-3-氰基-5-甲基乙酸乙酯的水解酶方法，得到较好的商品酶。中国专利CN109503401，利用脂肪酶对普瑞巴林进行手性拆分，获得了高手性产物，但拆分的收率最高仅有50％，限制了其应用。辉瑞在专利CN107746834中报道可利用转氨酶或其突变体合成普瑞巴林，虽然能够得到高的手性产物，但转换底物浓度过低且转化率不高，限制了其工业化的应用。大量文献报道采用脂肪酶制备普瑞巴林，专利CN1972904、CN103045559、CN103695385、CN103981160、CN104130987、CN104560912中均不同程度报道脂肪酶可以用来制备普瑞巴林中间体，但是转化率仅为40％左右，造成原料浪费。文献(Organic&BiomolecularChemistry，2013,11(22),3635)中报道合成普瑞巴林中间体的方法，如Scheme2所示。此路线中采用的脂肪酶为野生型，当R为甲基、乙基时，ee值为75％左右，当R为异丙基时，ee值也仅为93％，并不满足工业化生产的需要。专利WO2009158343报道一种脂肪酶及其在普瑞巴林中间体制备中的应用。通过酶法合成将3-异丁基戊二酸甲酯转化为S-3-异丁基戊二酸单甲酯，其中酶来自CalB(南极假丝酵母脂酶B)，收率为96％，ee为95.5％，但是实际上无法重现专利报道的结果。由于目前报道的酯水解酶转化率较低，手性纯度不高，因此需要寻找一种高选择性酯水解酶用于制备普瑞巴林。
技术实现思路
：为了克服现有技术存在的上述缺陷，本专利技术提供一种用于制备普瑞巴林中间体的高选择性酯水解酶突变体。本专利技术提供的酯水解酶突变体的氨基酸序列是以SEQIDNO.1所示的野生型酯水解酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为第141位的丙氨酸突变为亮氨酸，第154位的缬氨酸突变为精氨酸和第157位的谷氨酰胺突变为色氨酸。进一步，所述酯水解酶的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。进一步，所述酯水解酶的基因核苷酸序列为SEQIDNo.3所示。进一步，所述酯水解酶来源于CandidaAntarctica。进一步，所述酯水解酶用于制备普瑞巴林中间体。更进一步，所述酯水解酶用于制备普瑞巴林中间体，具体反应如式I所示：其中，R为甲基、乙基、异丙基、苄基，优选乙基。有益效果：本专利技术发现一种区别于野生型的酯水解酶突变体，对高浓度底物3-异丁基-戊二酸二乙酯进行立体选择性水解，获得的产物(S)-3-异丁基-戊二酸单乙酯的手性纯度大于98％，转化率达到100％。经过后期提取分离，收率达到97％，大幅度提高了合成效率，降低了生产成本，适合工业化生产。附图说明图1不同构型与酯水解酶的对接图，其中A为S型结构对接，B为R型结构对接图2突变体测序的比对图图3酵母转化子在平板上的表达图图4外消旋体3-异丁基-戊二酸单乙酯定位图图5底物3-异丁基-戊二酸二乙酯的定位图图6野生型固定化酶催化底物的HPLC手性分析图图7突变体固定化酶催化100g/L底物的HPLC手性分析图具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本专利技术的内容，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1酯水解酶突变体的理性构建来自南极假丝酵母的酯水解酶CalB具有一定的手性选择性，对底物3-异丁基-戊二酸二乙酯水解后可以获得S手性单酯产物的纯度在70％，为了进一步提高CalB的手性选择性，对其结构进行理性分析。以PDB数据库中的野生型结构1TCA为参考，分别将S-3-异丁基-戊二酸单乙酯和R-3-异丁基-戊二酸单乙酯与其半柔性对接，对接结果见附图1。从对接的结果中发现，想要提高S手性选择性，则需要将S结构伸向的空间释放更大些，更有利于S结构的摆放。相反，对于R结构的对接，需要蛋白结构中存在更大阻力，不利于R结构的摆放。从对接中找到三个影响主要位点141、154和157，分别对141、154和157进行其余19个氨基酸的突变构建，通过同源建模获得其他突变体的结构，再分别与S-3-异丁基-戊二酸单乙酯和R-3-异丁基-戊二酸单乙酯进行半柔性对接，分析每个突变体对接后的能量比较值ES/ER，这个值越小则越有利于蛋白选择S结构。通过一系列分析，最终确定A141L/V154R/Q157W的能量比值最小0.0045。分别对以上3个位点设计突变引物，利用全质粒PCR迭代突变获得突变体，具体引物设计见表1。表1定点突变的引物序列表1中带下划线的序列为突变位点，利用PrimerSTARmaxDNA聚合酶(TaKaRa公司)在正反向饱和引物的参与下，以重组质粒pPIC9K-CalB为模板，进行全质粒扩增反应，PCR反应程序参考表2。表2全质粒扩增程序表将获得的全质粒突变体转入DH5α感受态细胞中，涂布于含有30ug/mL的Kan+抗性LB平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆进行测序鉴定位点是否突变，测序比对结果见附图2，显示三个位点逐步叠加，实现了同时突变。为了在酵母体系表达突变体，需要利用限制性内切酶BglⅡ消化突变体重组质粒，产生线性的质粒，结合电转仪，将突变体基因整合到毕赤酵母染色体上。转化液加入冰冷的1M山梨醇，在30℃震荡培养箱中孵育1h后，涂布在含有100ug/mL的G418抗性YPD平板上，30℃培养3天，挑取单克隆准备发酵分泌表达蛋白突变体。实施例2酯水解酶突变体的分泌表达和制备随机挑取部分在抗性平板上生长的转化子，利用牙签转接到含有三丁酸甘油酯的乳化平板上，并在其平板盖上添加200uL的甲醇(终浓度为1％)，30℃倒置培养诱导重组菌体产酶，在培养2天后，转化子周围会出现透明圈见附图3，挑选形本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酯水解酶突变体，其特征在于，所述酯水解酶突变体的氨基酸序列是以SEQ IDNO.1所示的野生型酯水解酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为第141位的丙氨酸突变为亮氨酸，第154位的缬氨酸突变为精氨酸和第157位的谷氨酰胺突变为色氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种酯水解酶突变体，其特征在于，所述酯水解酶突变体的氨基酸序列是以SEQIDNO.1所示的野生型酯水解酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为第141位的丙氨酸突变为亮氨酸，第154位的缬氨酸突变为精氨酸和第157位的谷氨酰胺突变为色氨酸。


2.如权利要求1所述的酯水解酶突变体，其特征在于，所述酯水解酶的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示。


3.如权利要求1所述的酯水解酶突变体，其特征在于，所述酯...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小飞，王尧，竺伟，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31