雷帕霉素抗性细胞制造技术

本申请尤其涉及包含用于在宿主细胞中表达以使其对雷帕霉素具有抗性的蛋白质的组合物。本申请进一步涉及使用本文公开的蛋白质、细胞和组合物来调节细胞信号传导和用于细胞的选择性扩增的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】雷帕霉素抗性细胞相关申请的交叉引用本申请要求2018年4月27日提交的名称为“RAPAMYCINRESISTANTCELLS”的美国临时专利申请第62/663,562号的优先权的权益，以引用的方式在此将上述申请以其整体明确地并入本文。序列表的引用本申请与电子格式的序列表一起提交。将序列表作为2019年4月25日创建的标题为SCRI186WOSEQLISTING的文件提供，其大小为约120Kb。序列表的电子格式内的信息以引用的方式整体并入本文。
本文提供了化学诱导的信号传导复合物，其中，在雷帕霉素或相关化合物的存在下使两个组分连接在一起以产生活化的信号传导复合物，所述复合物与细胞内表达的裸露的FKBP-雷帕霉素结合蛋白结合使用来赋予宿主细胞雷帕霉素抗性。
技术介绍
雷帕霉素(也称为西罗莫司)是分离自细菌吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的复杂的大环内酯类天然产物，所述细菌于1975年在复活节岛(又称RapaNui)的土壤样品中发现(Huang,S.等，(2003).CancerBiol.Ther.,2(3):222-232；Abraham,R.T.等，(1996).Ann.Rev.Immunol.,14:483-510；Pollock,R.等，(2002).Curr.Opin.Biotechnol.,13(5):459-467；Bayle,J.H.等，(2006).Chem.Biol.,13(1):99-107)。雷帕霉素介导蛋白FKBP12(FK506结合蛋白12)和FRB(FKBP12雷帕霉素结合结构域)的异二聚化(Huang,S.等，(2003).CancerBiol.Ther.,2(3):222-232)。由于雷帕霉素的出色的生理特性(包括良好的药代动力学参数，例如穿过血脑屏障的膜通透性和溶解度的良好水平以及口服生物利用度(Abraham,R.T.等，(1996).Ann.Rev.Immunol.,14:483-510))，它已在哺乳动物细胞和生物体中的广泛的应用中被用作小分子二聚化剂(例如，Pollock,R.等，(2002).Curr.Opin.Biotechnol.,13(5):459-467)。CISC(化学诱导的信号传导复合物)是多组分合成蛋白复合物，其被配置用于作为两种嵌合蛋白在宿主细胞中共表达，如国际专利申请号PCT/US2017/065746中所述，以引用的方式将其公开内容整体并入本文。CISC的每个嵌合蛋白组分都具有雷帕霉素结合复合物的一半作为细胞外结构域，融合至细胞内信号传导复合物的一半。将编码CISC的核酸递送至宿主细胞允许可通过雷帕霉素或雷帕霉素相关化合物的存在进行控制的细胞中的细胞内信号传导。然而，尽管雷帕霉素驱动的CISC二聚化可以触发细胞内信号传导，但是雷帕霉素的存在还可以抑制宿主细胞的生长和活力，从而限制了它们用于治疗以及研究工作中的效用。因此，需要新的组合物和方法，所述组合物和方法允许使用雷帕霉素介导的CISC细胞内信号传导，但矫正了雷帕霉素或雷帕霉素相关化合物对宿主细胞的生长和活力的负面影响。
技术实现思路
本文尤其提供了用于使细胞对雷帕霉素具有抗性的组合物和方法。在一个方面，本文描述了一种系统，所述系统包括：(i)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码该DNA核酸内切酶的核酸；(ii)向导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸，该向导RNA包含与细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及(iii)包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，其中，DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过DNA核酸内切酶与gRNA的关联而形成的复合物能够促进供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。在一些实施方式中，DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。在一些实施方式中，将编码DNA核酸内切酶的核酸进行密码子优化以用于在经遗传修饰的细胞中表达；将编码gRNA的核酸进行密码子优化以用于在经遗传修饰的细胞中表达；和/或将供体盒中的一个或多个编码序列进行密码子优化以用于在经遗传修饰的细胞中表达。在一些实施方式中，供体模板被配置以使得供体盒能够通过同源介导修复(HDR)整合入靶基因组基因座中。在一些实施方式中，供体模板被配置以使得供体盒能够通过非同源末端连接(NHEJ)整合入靶基因组基因座中。在一些实施方式中，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，脂质体或脂质纳米颗粒进一步包含gRNA或编码gRNA的核酸。在一些实施方式中，该系统进一步包括与核糖核蛋白(RNP)复合物中的gRNA关联的DNA核酸内切酶。在一些实施方式中，提供了裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。在一些实施方式中，裸露的FRB多肽包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的氨基酸序列。在一些实施方式中，供体盒进一步包括编码二聚化可激活化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分的一个或多个核酸序列，其中，CISC的多肽组分包括：(i)第一CISC组分，包括第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；以及(ii)第二CISC组分，包括第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；其中，第一CISC组分和第二CISC组分被配置以使得当在细胞中表达时，它们能够在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(rapalog)的存在下二聚化，以产生具有信号传导能力的CISC。在一些实施方式中，第一或第二细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FRB结构域或其功能衍生物。在一些实施方式中，第一CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域，和/或所述第二CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域。在一些实施方式中，第一或第二CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体γ亚基(IL2Rγ)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体β亚基(IL2Rβ)结构域或其功能衍生物。在一些实施方式中，IL2Rβ结构域多肽被截短。在一些实施方式中，编码IL2Rβ结构域的核酸包括SEQIDNO：4的核苷酸序列。在一些实施方式中，IL2Rβ结构域包括SEQIDNO：5的氨基酸序列。在一些实施方式中，其中，雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903和AP23573以及它们的代谢物和衍生物。在一些实施方式中，编码裸露的FRB结构域的核酸在编码CISC的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种系统，所述系统包括：/n脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；/n向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸，所述向导RNA包含与细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及/n包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，/n其中，所述DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过所述DNA核酸内切酶与所述gRNA的关联而形成的复合物能够促进所述供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达所述裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180427 US 62/663,5621.一种系统，所述系统包括：
脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；
向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸，所述向导RNA包含与细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及
包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，
其中，所述DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过所述DNA核酸内切酶与所述gRNA的关联而形成的复合物能够促进所述供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达所述裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。


2.如权利要求1所述的系统，其中，所述DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。


3.如权利要求1-2中任一项所述的系统，其中，
将所述编码DNA核酸内切酶的核酸进行密码子优化以用于在所述经遗传修饰的细胞中表达；
将所述编码gRNA的核酸进行密码子优化以用于在所述经遗传修饰的细胞中表达；和/或
将所述供体盒中的一个或多个编码序列进行密码子优化以用于在所述经遗传修饰的细胞中表达。


4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述供体模板被配置以使得所述供体盒能够通过同源介导修复(HDR)整合入所述靶基因组基因座中。


5.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述供体模板被配置以使得所述供体盒能够通过非同源末端连接(NHEJ)整合入所述靶基因组基因座中。


6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其中，将所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。


7.如权利要求6所述的系统，其中，所述脂质体或脂质纳米颗粒进一步包含所述gRNA或编码所述gRNA的核酸。


8.如权利要求1-7中任一项所述的系统，所述系统包含与核糖核蛋白(RNP)复合物中的gRNA相关联的DNA核酸内切酶。


9.如权利要求1-8中任一项所述的系统，其中，所述裸露的FRB多肽包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的氨基酸序列。


10.如权利要求1-9中任一项所述的系统，其中，所述供体盒进一步包含编码二聚化可激活化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分的一个或多个核酸序列，其中，所述CISC的多肽组分包括：
i)第一CISC组分，所述第一CISC组分包括第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；以及
ii)第二CISC组分，所述第二CISC组分包括第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；
其中，所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置以使得当在细胞中表达时，它们能够在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的存在下二聚化，以产生具有信号传导能力的CISC。


11.如权利要求10所述的系统，其中，所述第一细胞外结合结构域或第二细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FRB结构域或其功能衍生物。


12.如权利要求10-11中任一项所述的系统，其中，所述第一CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域，和/或所述第二CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域。


13.如权利要求10-12中任一项所述的系统，其中，所述第一CISC组分或第二CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体γ亚基(IL2Rγ)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体β亚基(IL2Rβ)结构域或其功能衍生物。


14.如权利要求13所述的系统，其中，所述IL2Rβ结构域多肽被截短。


15.如权利要求13所述的系统，其中，编码所述IL2Rβ结构域的核酸包含SEQIDNO：4的核苷酸序列。


16.如权利要求13所述的系统，其中，所述IL2Rβ结构域包含SEQIDNO：5的氨基酸序列。


17.如权利要求10-16中任一项所述的系统，其中，所述雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903和AP23573以及它们的代谢物和衍生物。


18.如权利要求10-17中任一项所述的系统，其中，编码所述裸露的FRB结构域的核酸在编码所述CISC的多肽组分的所述一个或多个核酸序列的下游。


19.如权利要求1-18中任一项所述的系统，其中，所述供体盒进一步包含编码如下之间的自切割多肽的核酸序列：(i)编码所述CISC的多肽组分的所述一个或多个核酸序列中的每一个；和/或(ii)编码所述裸露的FRB结构域的核酸和编码所述CISC的多肽组分的相邻核酸序列。


20.如权利要求19所述的系统，其中，在所述供体盒中编码的所述自切割多肽的每一个独立地选自于由P2A、T2A、E2A和F2A所组成的组。


21.如权利要求1-20中任一项所述的系统，其中，所述供体盒进一步包括可操作地连接至所述供体盒中的一个或多个编码序列的启动子。


22.如权利要求21所述的系统，其中，所述启动子是诱导型启动子或组成型启动子。

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【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·M·沙尔博格，戴维德·J·罗林斯，凯伦·索默，塞缪尔·韦斯特，玉池·蒋·霍纳克，竹内亮，
申请(专利权)人：西雅图儿童医院DBA西雅图儿童研究所，
类型：发明
国别省市：美国;US