６、１１型人乳头瘤病毒荧光定量ＰＣＲ检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及人６、１１型人乳头瘤病毒荧光定量ＰＣＲ检测方法及其试剂盒和用于人乳头瘤病毒６、１１型苷酸片段的ＰＣＲ扩增引物和探针序列。引物序列包括：人乳头瘤病毒６、１１型通用上游引物和通用下游引物组成的引物对，及上游引物互补序列或下游引物互补序列，还包括上游引物向５’端方向及下游引物向３’端方向延伸１０个碱基，向５’端方向延伸１０个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括：荧光探针：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３及互补序列，以及向３’端和５’端延伸１０个碱基区域范围内得到的探针序列。此方法可用于６、１１型人乳头瘤病毒定量检测，具有实际的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速定量检测6、 11型人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于 生物

技术介绍
人类乳头状瘤病毒(Humanpapillomavirus, HPV)是一种嗜上皮性病毒， 在人和动物中分布广泛，有高度的特异性，长期以来，己知HPV可引起人类良 性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣 以及生长在粘膜上的乳头状瘤。HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，HPV 基因组是一闭环双股DNA，分子量5><106道尔顿。按功能可分为早期区(E区)、 晚期区(L区)和非编码区(ncr)三个区域。E区分为E1 E7开放阅读框架，主 要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。L区分L1和L2，分别编 码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。ncr是E区与L区间-6.4 1.0bp的DNA片段，可 负责转录和复制的调控。临床上，根据HPV亚型的致病力大小或致癌危险性大小不同，可将HPV分 为低危型和高危型两类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性 大小阴唇、尿道口、阴道部位的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤，其病 毒亚型中最常见的有HPV6、 11型。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是可引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤，其病毒亚型中最常见 的有HPV16、 18、 31、 33型。HPV(6 ,11)引起生殖器尖锐湿疣,组织学特征为棘层出现成片的空泡化细胞, 棘层细胞及基底细胞增生,炎细胞浸润,但在慢性炎症及其它病毒感染,也出现空泡或空泡样变。尖锐湿疣病程较长者,空泡化细胞数量稀少或单个分散。因此在 某些仅表现非典型病变的病例进行病毒检测显得尤为重要。国外有不少学者报告，在尖锐湿疣中由HPV6、 ll型引起的尖锐湿疣感染占9()%以上，，少数为HPV16、 18型感染或HPV3()、 3,33、 35型感染或与HPVU、i6型等亚型混合感染。在我国，--.些研究表明尖锐湿疣损害中HPV亚型所占百 分比各有不同。朱学骏等对250例尖锐湿疣的HPV感染进行分型，结果表明尖锐 湿疣感染亚型以HPV6型及HPV11型最为常见，感染率分别为84%和68%，但高 危型HPVI6、 18型感染并不少见，分别为14%和16%，结果还表明尖锐湿疣复合 感染常见，达66%，以HPV6、 ll型复合感染最常见。刘宝印等在2()6例宫颈尖 锐湿疣患者HPV阳性的84例中，HPV6、 11型检出率为33.5%， HPV16型为1.5X， HPV18型为()X ，其他HPV亚型为5.8X 。目前检测病毒有多种方法,免疫组化法检测的是病毒抗原,由于病毒DNA在 转录时部分丢失，蛋白水平降低，致使有些有典型组织学改变的病例也出现阴性。 原位杂法是利用探针与组织中的DNA杂交,首先将探针和组织中的双链DNA 变性为单链,然后使探针与组织杂交,而影响原位杂交的关键因素是杂交链的稳 定性，在杂交过程中,部分探针单链复性，使杂交率降低,影响HPV2DNA的检出 率。FQPCR是近儿年发展起来的新的核酸检测技术，该技术在常规PCR基础上添 加了一条标记了2个荧光基因的荧光双标记探针。 一个标记在探针的5'端，称 为荧光报告基团；另一个标记在探针的3'端，称为荧光抑制基团。两者构成能 量传递结构，即5'端荧光基团所发出的荧光可被3'端荧光基团吸收或抑制。 实时荧光定量PCR技术在PCR过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变 化。当信号增长到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，计算出 以99. 7%的置信度大于甲-均值的荧光值，即为阈值)时，循环次数(Ct值)就被记录下来。该循环参数和PCR体系屮起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。 利用阳性梯度标准品的Ct值，制成标准曲线，再根据样品的Ct值就可以准确定 出起始DNA的数量。FQ-PCR技术把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物 分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增 产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术从根本上解决了 PCR扩增产物 污染和不能定量的问题，并且通过探针杂交进一步提高了检测HPV DNA的特异性。采用实时FQ—PCR方法检测HPV感染，具有快速、简便、灵敏度高、特异 性强等优点，既适用于大规模筛查也适用于临床日常工作中采用。
技术实现思路
木专利技术目的在于提供一种精确简便的用于定量6、 ll型人乳头瘤病毒的方法； 本专利技术的另一 目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。为了检测出临床样品中可能存在的6、 ll型人乳头瘤病毒，并能够准确有效 的将其余亚型HPV病毒、单纯疱疹病毒2型、生殖支原体、巨细胞病毒、解脲 脲原体、沙眼衣原休、淋病双球菌及其他常见泌尿生殖道感染病原体鉴别开来， 设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。 为此，我们在使用适当的核酸分析软件对一直HPV病毒型的基因组核苷酸序列 及进行同源性比较，并在找出同源性区段的基础啊上，进一步使用适当的引物 设计软件(如Primer premier5.0)选择并设计引物。本专利技术所涉及的引物所对应的 扩增区段相当于HPV病毒L2基因编码序列的保守区，长度为108bp。所设计的 这些引物和探针均具与其他型别HPV病毒及其他泌尿生殖道感染相关病原体的核苷酸序列没有同源性，大大减少甚至避免了 HPV6、 U型检测的假阳性和假阴性，提高了检测的可靠性和准确性。基于h述目的，本专利技术采用以下技术方案 、用于检测人乳头瘤病毒6、 ll型核苷酸片段的引物及探针序列包括引物序列包括由上游引物序列5，---GATTGACAATGGGACTGT-—3，(SEQ ID N0:1)和下游引物序列为5'—TAAAGCAGGAGTTACAGG—3， (SEQ ID N0:2)组成的引物对，以及上游引物的互补序列5，-- ACAGTTCCATTGTCAATT--3， 、 5，-一ACAGTCCCATTGTCAATC—3 ，和f游引物的互补序列5 ， --CTGTAACTCCTGCTTTA—3 ，。还包括上游引物向5'端方向延伸10个碱基，下游引物向3'端方向延伸10个碱基，向5'端方向延伸l()个碱基区域范围内得到的引物序列。探针序列包括由5，一GGTGTTCCCATAGATGCAGTA—3，(SEQ工DN0:3)，及其互补序列5，一 ACTGCACCTATGGGAACACC—3， 、 5，一 TACTGCATCTATGGGAACACC—3，。以及向3'端方向延伸1()个碱基和向5'端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列。本专利技术在常规PCR检测技术的基础上，添加一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团(FAM)标记在探针的5'端，荧光淬灭基团(TAMRA)标记在3'端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，Taq酶的5，端外切酶活性将特异性结合在目的扩增片断上的荧光探针酶切降本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于６、１１型人乳头瘤病毒荧光定量ＰＣＲ检测方法及其试剂盒和实时荧光ＰＣＲ的引物对及探针。其特征在于所述的引物序列包括：由上游引物序列５’－ＧＡＴＴＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＣＴＧＴ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）和下游引物序列为５’－ＴＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＡＣＡＧＧ－３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）组成的引物对，以及上游引物的互补序列５’－ＡＣＡＧＴＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡＡＴＴ－３’、５’－ＡＣＡＧＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＡＡＴＣ－３’和下游引物的互补序列５’－ＣＴＧＴＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＡ－３’。

【技术特征摘要】
1.用于6、11型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和实时荧光PCR的引物对及探针。其特征在于所述的引物序列包括由上游引物序列5’-GATTGACAATGGGACTGT-3’(SEQ ID NO1)和下游引物序列为5’-TAAAGCAGGAGTTACAGG-3’(SEQ ID NO2)组成的引物对，以及上游引物的互补序列5’-ACAGTTCCATTGTCAATT-3’、5’-ACAGTCCCATTGTCAATC-3’和下游引物的互补序列5’-CTGTAACTCCTGCTTTA-3’。2. 根据权利要求1所述的用于6、 ll型人乳头瘤病毒荧光PCR检测的引物序列， 其特征在于所述的引物序列包括上游引物向5'端方向延伸10个碱基，下游引物 向3'端方向延伸l()个碱基，向5'端方向延伸10个碱基区域范围内...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑宜婷，唐先兵，石和鹏，李晓雯，肖静，
申请(专利权)人：扬子江药业集团北京海燕药业有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]