一种制备条斑紫菜Ｒ－藻红蛋白荧光探针的方法技术

一种制备条斑紫菜Ｒ－藻红蛋白荧光探针的方法，特征是该方法在温度为２０℃条件下进行以下各步骤：先以３－（２－吡啶二巯基）丙酸ｎ－羟基琥珀酰亚胺酯与Ｒ－藻红蛋白摩尔比为４０∶１进行Ｒ－藻红蛋白的衍生化，摇床避光低速振荡２小时，用Ｓｅｐｈａｄｅｘ？Ｇ－２５脱盐柱收集衍生化的Ｒ－藻红蛋白；再以二硫苏糖醇与抗体摩尔比为５００∶１进行抗体的巯基化，摇床低速振荡１小时，用Ｓｅｐｈａｄｅｘ？Ｇ－２５脱盐柱收集巯基化的抗体；最后按衍生前Ｒ－藻红蛋白与抗体的质量比３∶５的比例取衍生化的Ｒ－藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡１２小时，后加入１００μｌ的Ｎ－乙基马来酰亚胺，反应３０分钟，接着以Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ？Ｓ－３００ＨＲ层析柱分离纯化，洗脱液为５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化纳、ｐＨ７．０，收集分离的交联产物，即为条斑紫菜Ｒ－藻红蛋白荧光探针。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备藻胆蛋白荧光探针的方法，特别是涉及一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法。
技术介绍
藻胆蛋白是很好的纯天然色素，有鲜艳的颜色，可用作食物色素、化妆品、添加剂等，同时，藻胆蛋白也是一种新型荧光物质，包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白等，可以作为抗体荧光标记物质以替代合成荧光物质，它们作为生物体内的荧光示踪物质，正被广泛应用于临床诊断、免疫标记等领域。特别是R-藻红蛋白(R-PE)因其极高的消光系数和量子产率，较大的斯托克(STOKES)位移，以及其黄橙色特征荧光，可以避开大多数生物环境中的内源荧光分子干扰，制成的荧光探针的检测效果显著高于传统的荧光标记物。但由于荧光探针制备工艺难度较大，所用的藻红蛋白及单克隆抗体的纯度要求又较高，使目前国内科研和医疗单位使用的藻红蛋白荧光标记物完全依赖进口 ，成为限制其扩大应用的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，它不但能高效地制备R-藻红蛋白荧光探针，而且，工艺简单，成本低廉。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术的一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法在温度为2(TC条件下进行以下各步骤 (1)以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与R-藻红蛋白(R-PE)摩尔比为40 : l进行R-藻红蛋白(R-PE)的衍生化，摇床避光低速振荡2小时，用S印hadex G-25脱盐柱收集衍生化的R-藻红蛋白(R-PE); (2)以二硫苏糖醇(DTT)与抗体摩尔比为500 : 1进行抗体的巯基化，摇床低速振荡1小时，用S印hadex G-25脱盐柱收集巯基化的抗体； (3)按衍生前R-藻红蛋白与抗体的质量比3 : 5的比例取衍生化的R-藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡12小时，后加入100 的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，接着以S印hacryl S-300HR层析柱分离纯化，洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液+150咖01/1氯化纳、1^7.0，收集分离的交联产物，即为条斑紫菜1 -藻红蛋白(R-PE)荧光探针。 所述的摇床低速震荡为50转/分。 所述的N-乙基马来酰亚胺为用无水二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为80mmol/L。所述的S印hacryl S-300HR层析柱为C 16mmX1000mm的S印hacrylS-300HR层析柱。 由于本专利技术以条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)为材料，通过R-藻红蛋白(R-PE)衍生化、抗体巯基化，交联产物分离纯化等方法制备条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针，因此，具有以下优点 1、藻胆蛋白来源丰富，我国是紫菜生产大国，年产量20亿张左右，目前市场上大多是自然凉干的紫菜，销售价格在每千克20-30元，而每吨饲料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60-80元/千克)，曾一度高达每kg30美元(约240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本专利技术所用原料来源广泛，无需加工，成本相对于螺旋藻便宜的多； 2、目前从条斑紫菜提取高纯度藻红蛋白工艺简单，成本低廉，得率较高； 3、R-藻红蛋白(R-PE)检测效果好，R-藻红蛋白(R-PE)因其极高的消光系数和量子产率，较大的斯托克(STOKES)位移，以及其黄橙色特征荧光，可以避开大多数生物环境中的内源荧光分子干扰，制成的R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针的检测效果显著高于传统的荧光标记物。附图说明 图1是在明场下肝癌SMCC-7721细胞的形态。 图2是在绿色激发光下羊抗兔抗体检测SMCC-7721细胞(对照组)。 图3是在绿色激发光下R-藻红蛋白荧光探针检测SMCC-7721细胞。 图4是在绿色激发光下R-藻红蛋白衍生物R-PE-PDP检测SMCC-7721细胞(对照组)。 图5是在蓝色激发光下R-藻红蛋白荧光探针检测SMCC-7721细胞。 图6是在蓝色激发光下R-藻红蛋白衍生物R-PE-PDP检测SMCC-7721细胞(对照组)。具体实施例方式实施例1 本实施例中所用的材料为条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)和羊抗兔抗体，所述的条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)从上海安谱科学仪器有限公司购得，所述的羊抗兔抗体从武汉华美生物工程有限公司购得。 (1)、以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与R-藻红蛋白(R-PE)摩尔比为40 : l进行R-藻红蛋白(R-PE)的衍生化，在摇床以50转/分避光振荡2小时，再用S印hadex G-25脱盐柱去除未反应的3_(2_吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，收集衍生化的R-藻红蛋白(R-PE); (2)、以二硫苏糖醇(DTT)与羊抗兔抗体摩尔比为500 : 1进行羊抗兔抗体的巯基化，在2(TC下，在摇床以50转/分振荡1小时，用S印hadex G-25脱盐柱去除未反应的二硫苏糖醇(DTT)，收集巯基化的羊抗兔抗体； (3)、按衍生前R-藻红蛋白(R-PE)与羊抗兔抗体的质量比3 : 5的比例取衍生化的R-藻红蛋白(R-PE)与巯基化的羊抗兔抗体混合，在摇床以50转/分震荡，反应12小时，后加入100 iil的用无水二甲基亚砜(DMSO)溶解的浓度为80mmol/L的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，再以S印hacrylS-300HR层析柱(<2 16mmX1000mm)分离纯化，洗脱液为50mmol/L磷酸盐缓冲液+150mmol/L氯化纳、PH7. 0，收集分离的交联产物，即制得条斑紫菜R-藻红蛋白(R-PE)荧光探针。 上述各步骤在温度为2(TC条件下进行。 实施例2 条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针在肝癌SMCC-7721细胞检测上的应用步骤如下 1.取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干，用0.9%氯化纳溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入肝癌SMCC-7721细胞培养过夜。 2.吸尽六孔板内培养液，加入lml固定液，4t:固定过夜。 3.去除固定液，用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，吸尽液体。 4.用封闭液封闭60分钟。 5.去除封闭液，加稀释的兔抗肌动蛋白多克隆抗体(1 : 400)作用60分钟。 6.去除一抗，用洗涤液洗涤3-5次，每次3-5分钟。 7.去除洗涤液，加入1毫升R-藻红蛋白荧光探针作用60分钟。 8.回收荧光标记的二抗。用洗涤液洗涤盖玻片3-5次，每次3-5分钟。 9.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液。 10.在荧光显微镜下用绿光激发，观察并拍照。 同时以异双功能试剂衍生化但未与羊抗兔抗体交联的R-藻红蛋白衍生物(R-PE-PDP)及单独使用羊抗兔抗体作对照组。 结果 图1是肝癌SMCC-7721细胞在明场情况下20倍的照片，细胞形态清楚可与其后的荧光激发图片做对比。 图2显示只与羊抗兔抗体结合的SMCC-7721细胞自身不具有荧光能用于荧光标记检测。 经兔抗肌动蛋白多克隆抗体处理的肝癌细胞能与R-藻红蛋白荧光探针发生特异性的结合，在绿色激发光下显示出红色的细胞形态(图3)，与对照组(图4)相比，其荧光强度大细胞形态清晰明显，说明未与抗体交联的衍生化R-PE大部分未与肝癌细胞上的第一抗体(兔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备条斑紫菜Ｒ－藻红蛋白荧光探针的方法，其特征在于该方法在温度为２０℃条件下进行以下各步骤：（１）以３－（２－吡啶二巯基）丙酸ｎ－羟基琥珀酰亚胺酯与Ｒ－藻红蛋白摩尔比为４０∶１进行Ｒ－藻红蛋白的衍生化，摇床避光低速振荡２小时，用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５脱盐柱收集衍生化的Ｒ－藻红蛋白；（２）以二硫苏糖醇与抗体摩尔比为５００∶１进行抗体的巯基化，摇床低速振荡１小时，用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５脱盐柱收集巯基化的抗体；（３）按衍生前Ｒ－藻红蛋白与抗体的质量比３∶５的比例取衍生化的Ｒ－藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡１２小时，后加入１００μｌ的Ｎ－乙基马来酰亚胺，反应３０分钟，接着以ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００ＨＲ层析柱分离纯化，洗脱液为５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化纳、ＰＨ７．０，收集分离的交联产物，即为条斑紫菜Ｒ－藻红蛋白荧光探针。

【技术特征摘要】
一种制备条斑紫菜R-藻红蛋白荧光探针的方法，其特征在于该方法在温度为20℃条件下进行以下各步骤(1)以3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯与R-藻红蛋白摩尔比为40∶1进行R-藻红蛋白的衍生化，摇床避光低速振荡2小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集衍生化的R-藻红蛋白；(2)以二硫苏糖醇与抗体摩尔比为500∶1进行抗体的巯基化，摇床低速振荡1小时，用Sephadex G-25脱盐柱收集巯基化的抗体；(3)按衍生前R-藻红蛋白与抗体的质量比3∶5的比例取衍生化的R-藻红蛋白与巯基化的抗体混合，摇床低速震荡12小时，后加入100μl的N-乙基马来酰亚胺，反应30分钟，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何培民，蔡春尔，周铭，汪卿，柳俊秀，李春霞，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]