提高紫菜藻红蛋白活性的生物修饰制备方法技术

本发明专利技术涉及一种提高紫菜藻红蛋白活性的生物修饰制备方法，属于海洋生物功能成分制备技术领域。紫菜经ＰＢＳ缓冲液溶胀，用超声波细胞破碎破壁得到粗提物，再用饱和度２０％～４５％硫酸铵沉淀透析，得到纯度（Ａ↓［５６２］／Ａ↓［２８０］）达到３．０４的紫菜藻红蛋白。再经木瓜蛋白酶生物修饰，酶浓度１５０００～２５０００μ／ｇ；ｐＨ６．５～７．５；温度５０～６０℃；时间２ｈ。修饰后的藻红蛋白活性显著提高，还原力（Ａ↓［７００ｎｍ］）增加至０．５７３，羟自由基清除能力增加至５１．０３％，分别增加了０．３２９和３５．１７％。本发明专利技术创立了提高紫菜藻红蛋白抗氧化活性的方法，生物修饰后的藻胆蛋白在医药和功能食品领域更具应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于海洋生物功能 成分制备
，用于研制开发医药保健品和功能食品的基料。二
技术介绍
藻胆蛋白是藻类藻胆体中的捕光色素蛋白，能把捕获的光能高效的传递给叶绿 素，从而使海藻的光合作用得以发生。藻胆蛋白主要包括藻蓝蛋白(Phycocyanin)、 藻红蛋白(Phycoerythrim)和别藻蓝蛋白(Allphycocyanin)三类，其中藻蓝蛋白(PC) 和藻红蛋白(PE)在藻体中的含量较为丰富。藻胆蛋白是一种非常重要的光动力药物的原料，特有的光敏效应可辅助激光治 癌，在病灶部位富集，吸收光后高效产生自由基和活泼态氧，从而实现对肿瘤细胞的 杀伤。有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢快。藻胆蛋白可作为功能因子用于保健 食品和功能食品及特殊饲料，同时还是理想的天然色素，可大量用于食品工业和化妆 品工业等，无毒副作用，是安全的添加剂。藻胆蛋白还具有抗氧化清除自由基和提高 免疫力的功效。其制作的免疫荧光标记抗体，检测灵敏度远远高于传统的荧光标记物， 可用于特殊分子定位和重要分子检测，包括SARS病毒的免疫分子检测，能准确地诊 断肿瘤、确定病变部位和病情轻重程度等。我国海域宽广，藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，我国养殖和 加工又主要集中在江苏沿海，其产量占全国的95%以上。紫菜的市场价格便宜，是红 毛菜的1/10,小球藻和螺旋藻的1/3。紫菜中藻红蛋白含量很高，如条斑紫菜所含粗 蛋白质约40%,其中藻胆蛋白约占4%,其藻胆蛋白绝大部分为藻红蛋白。选用紫菜 提取藻红蛋白，具有成本低，得率高的优点，极具研究价值。藻红蛋白颜色鲜艳，营养丰富，在天然使用色素方面有广泛的应用前景，但其稳定性及活性较低，且易沉淀。在实际应用中，许多因素影响着紫菜藻红蛋白的稳定性， 因此本专利技术用木瓜蛋白酶酶解的生物修饰方法来制备藻胆蛋白色基短肽。修饰后的这 些色基短肽既保留了原来鲜艳的颜色、丰富的营养等优点，还克服了藻胆蛋白稳定性 差的缺点。因此，蛋白酶解修饰是使其得到更合理、更充分利用的一种好方法。与传统的碱、酸物理修饰方法相比，生物修^饰的蛋白水解液中具有更多的营养成 分，研究己经发现蛋白经酶解后，其水解产物的功能特性发生了极大的变化，颜色也 有较大的改变，这主要是因为大的蛋白分子被酶切成了大小不等的肽段和游离氨基 酸，改变了原有蛋白的特性，并且，经过生物修饰后，蛋白的功能会变得更加和谐。 蛋白质经酶解作用生物修饰后，功能和品质得到了进一步的提高，蛋白酶解产生的分 子量较小的肽可以被人体直接吸收，而且小肽比单个的氨基酸有着更好的消化吸收性 能，同时具有更优越的营养和生理功效。不同蛋白酶的选择会极大的影响水解产物的理化功能特性，这主要是因为，不同 的蛋白酶酶解海洋蛋白后，由于酶切位点的位置及多少的不同，会造成酶解片断分子 量大小的差异和氨基酸组成的变化。比如胰蛋白酶酶解位点较少，只有Arg和Lys 右侧的肽键，所以用它作用蛋白资源后， 一般酶解的片断都较大，而胃蛋白酶的酶解 位点为芳香族氨基酸、木瓜蛋白酶酶切位点在Arg、 Lys和Gly处的肽4定等，所以， 不同酶的选择对生物修饰后的蛋白质理化性质有较大影响。本专利技术选择木瓜蛋白酶， 因藻红蛋白中甘氨酸、赖氨酸及精氨酸的含量较高，经木瓜蛋白酶生物修饰的位点较 多，生物功能性价值可得到明显提高。人体内的&02可产生羟自由基，可攻击核酸、蛋白质、脂质及糖类等生物大分 子，*OH积累过量或生物体内抗氧化防御体系削弱时，易损伤细胞及组织，引起机体 衰老或癌变引起细胞的氧化、衰老甚至死亡，人的衰老、血栓动脉硬化、癌症、高血 脂等许多疾病都与之有密切关系。还原力是供电子能力的衡量标准，还原力强的样品 为良好的电子供应者，其供应的电子可与自由基反应而清除自由基，还原力越强，抗 氧化性越强。所以还原力及鞋自由基清除能力是衡量样品的重要指标，这两种活性的提高令今后紫菜的深加工成为可能，并具有重要的意义。该专利技术技术率先采用木瓜蛋白酶修饰紫菜藻红蛋白的生物修饰方法，运用正交技 术确定了影响生物修饰关键因子的最佳修饰条件，经生物修饰后的藻红蛋白抗氧化能 力有大幅度的提高，具有较高的应用于化妆品、医药保健品、药品等领域的价值。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种提高紫菜藻红蛋白活性的生物修饰方法。该方法成本低 廉，简便，高效，得到的藻红蛋白具有活性高，无毒、安全的特点，达到药品级要求， 具有较高的应用于化妆品、医药保健品和检测试剂等领域的价值。技术方案，其特征在于(1) 紫菜经50倍体积的lmM， pH6.8的PBS緩冲液溶月长24 h,再用800瓦功率 超声波作用1200秒进行细胞破碎，得到藻红蛋白的粗提物，四层纱布过滤后，用饱 和度为20%~45%的硫酸铵沉淀、流水透析48h两次，得纯度为3.04的药品级藻红蛋 白(食品级A562/A280 > 0.7;药品级A562/A28o〉2.0;试剂级A562/A280 〉 4.0 )。即藻红蛋白的粗提物用饱和度为20% ~45%的硫酸铵沉淀，5000 rpm, 20 min离 心，将沉淀溶于lmM， pH6.8的PBS緩冲液中，流水透析48小时，直至20%氯化钡 检验无白色沉淀，再次用饱和度为20%~45%的疏酸铵沉淀，5000rpm, 20min离心， 再将沉淀溶于lmM, pH6.8的PBS緩冲液中，流水透析48小时，直至20%氯化钡检 验无白色沉淀，透析后样品冷冻干燥即获得药品级A562/A280 >2的藻红蛋白。(2) 将藻红蛋白用lmM, pH6.8的PBS緩冲液溶解，使藻红蛋白浓度达到 lmg/mL，加入木瓜蛋白酶对藻红蛋白进行生物修饰，分别建立修饰时间、酶添加量、 緩冲液pH、修饰温度四因素单因素实验，并通过正交试验确定修饰最佳条件。修饰 的条件为木瓜蛋白酶酶浓度15000~25000 p/g; pH6.5 7.5;修饰温度50~60 。C; 修饰时间2h。将酶解液冷冻干燥后得到生物修饰后的藻红蛋白。5有益效果本专利技术创立了提高紫菜藻红蛋白抗氧化活性的方法，生物修饰后的藻胆蛋白在医 药和功能食品领域更具应用价值。本专利技术采用超声波细胞破碎、錄u酸铵两次分步沉淀、透析后的得到的藻红蛋白纯度(A562M/A280nm )达到3.04,达到药品级要求(食品级A562/A280 〉 0.7;药品级A562/A280 >2.0;试剂级八562/八280 〉4.0)，可应用于食品、化妆品、医药保健和检测试剂等领域， 可用作分子探针和光敏剂等，大大提高了紫菜的深加工价值。经过木瓜蛋白酶生物修 饰的藻红蛋白(lmg/mL)活性显著提高，还原力(A7oonm)为0.573,羟自由基清除 能力增加至51.03%,分别增加了 0.329和35.17%。四附图说明图1生物修饰藻红蛋白工艺路线五、 专利技术的具体实施例方式实施例1(1) 称取20克紫菜粉，按体积比1:50的比例用lmM， pH6.8的PBS緩冲液浸 泡24小时，充分溶胀。在冰浴中用800 W功率的超声波超声1200 s进行细胞破碎。 在5000 rpm条件下离心20 min，得藻红蛋白粗溶液；(2) 藻红蛋白粗溶液四层纱布过滤，用饱和度为20%~本文档来自技高网...

【技术保护点】
提高紫菜藻红蛋白活性的生物修饰制备方法，其特征在于：　（１）紫菜经４０～５０倍体积的１ｍＭ，ｐＨ６．８的ＰＢＳ缓冲液溶胀，再用８００瓦功率超声波作用１２００秒进行细胞破碎，得到藻红蛋白的粗提物，四层纱布过滤后用饱和度为２０％～４５％的 硫酸铵沉淀、流水透析４８ｈ两次，得药品级Ａ５６２／Ａ２８０＞２藻红蛋白；　（２）将藻红蛋白用１ｍＭ，ｐＨ６．８的ＰＢＳ缓冲液溶解，使藻红蛋白浓度达到１ｍｇ／ｍＬ，加入木瓜蛋白酶对藻红蛋白进行生物修饰，修饰的条件为：木瓜蛋白酶酶浓度：１ ５０００～２５０００μ／ｇ；ｐＨ６．５～７．５；修饰温度：５０～６０℃；修饰时间：２ｈ，将酶解液冷冻干燥后得到生物修饰后的藻红蛋白。

【技术特征摘要】
1、提高紫菜藻红蛋白活性的生物修饰制备方法，其特征在于(1)紫菜经40～50倍体积的1mM，pH6.8的PBS缓冲液溶胀，再用800瓦功率超声波作用1200秒进行细胞破碎，得到藻红蛋白的粗提物，四层纱布过滤后用饱和度为20％～45％的硫酸铵沉淀、流水透析48h两次，得药品级A562/A280＞2藻红蛋白；(2)将藻红蛋白用1mM，pH6.8的PBS缓冲液溶解，使藻红蛋白浓度达到1mg/mL，加入木瓜蛋白酶对藻红蛋白进行生物修饰，修饰的条件为木瓜蛋白酶酶浓度15000～25000μ/g；pH6.5～7.5；修饰温度50～60℃；修饰时间2h，将酶解液冷冻干燥后得到生物修饰后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡秋辉，赵殿锋，杨方美，安辛欣，辛志宏，赵立艳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]