一种猪瘟病毒Ｅ２次单位疫苗及其制备制造技术

本发明专利技术是使用家蚕（Ｓｉｌｋｗｏｒｍ）是统平台量产猪瘟病毒（ｃｌａｓｓｉｃａｌ？ｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ？ｖｉｒｕｓ）基因亚型２．１（ｓｕｂｇｒｏｕｐ？２．１）的重组Ｅ２蛋白。本发明专利技术亦提供一种包含上述重组蛋白的次单位疫苗，可用以提高猪只抵抗猪瘟病毒感染的能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种猪瘟疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪瘟为台湾及世界部分地区养猪业所面临的最严重疾病之一。猪瘟病毒的天然宿 主只有驯养猪及野猪，病毒对任何年龄的猪皆具感受性及伤害性。目前除少数特殊目的养 猪场未使用疫苗防治及欧美国家采扑杀政策外，几乎所有猪只在成长过程中最少须使用两 次以上疫苗才能免于猪瘟的危害。而目前台湾每年生产毛猪数量仍维持在600万头以上， 东南亚、中国及南美洲产量更数十倍于此，因此具保护作用的次单位疫苗对于该市场具有 非常高的经济价值。 全世界使用最广泛的猪瘟疫苗为兔化减毒疫苗或细胞减毒疫苗，例如台湾使用的 兔化疫苗(LPC)已连续通过兔体继代减毒l，OOO代以上(刘永和1978，台湾畜牧兽医学会 会报32 :38-39);而日本使用的细胞培养疫苗(GP)是将病毒于天竺鼠肾细胞减毒(林再 春等1969，台湾省畜卫所研报6 :1-10 ;谢竹茂等1981，台湾省畜卫所研报7 :13-16)。但减 毒疫苗存在的缺点是容易受移行抗体干扰与免疫后的抗体反应无法与野外病毒感染区分。 因此1990年代以后欧洲国家如德国及荷兰已相继开发E2次单位疫苗(Kretzdornet al.， 2005.美国专利技术专利第6， 919， 085号；Bouma et al. ， 1999. Vet. Microbiol. 66 :101-114 ; Ahrens et al. ， 2000. Vet. Microbiol. 77 :83-97 ;葡Ge皿ip et al. ， 2002. Vaccine 20 :1544-1556)，其最大优点可做为野外病毒感染的区别诊断(van Rijn et al. ， 1999. Vaccine 17 :433-440)，然欧洲的生产是统为昆虫杆状病毒(AcNPV)及昆虫细胞(Sf21)，其 制程长且生产的疫苗成本相当高不适合量产使用。 1986年日本Dr. Yanai则首先使用家蚕杆状病毒(BmNPV)当做载体(Maeda et al. ， 1985，Nature 3 15 :592-594 ;美国专利技术专利第5， 480， 956号)大量生产外源性重组蛋 白猫科动物干扰素(Feline interferon)。 猪瘟病毒在台湾已存在长久并持续威胁养猪产业，然1996年后发现外来病毒株 (基因亚型2. 1型，Subgroup 2. 1)已完全取代本土型病毒株(基因亚型3. 4型，Subgroup 3.4)现象(Deng et al. ， 2005， Vet. Microbiol. 106 :187-193 ;Lin et al. ， 2007. Virus Genes 35:737-744)且其抗原性与原来本土型病毒已有差异。此外，荷兰及德国开发的E2 次单位疫苗是利用细胞培养法生产，进口贩卖价格达30元台币以上，对于饲主在成本上形 成不小的负担。因此，如何根据新入侵型病毒株基因亚型2. 1开发有效疫苗，以减少猪只感 染并降低养猪业的损失，同时又能兼具低生产成本的优点，将是一个极需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的特征在于使用家蚕作为蛋白产制平台，其方法为使用家蚕杆状病毒 (BmNPV)，携带一重组猪瘟病毒E2基因于家蚕虫体中增生表现，并于家蚕体液中表现该重 组猪瘟病毒E2蛋白。本专利技术的另一特征即为将其重组E2蛋白开发成猪瘟E2次单位疫苗，便于大量制造，且每剂量疫苗抗原成本大幅降低。因此，本专利技术是提供一种制备猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括 (1)选殖一重组猪瘟病毒E2基因于一适当载体中； (2)以该带有猪瘟病毒E2基因的载体与一家蚕杆状病毒(Baculovirus ;BmNPV) 的基因体共同转染家蚕细胞(BmN)，使其自然发生基因重组反应而得到带有E2基因的重组 家蚕杆状病毒； (3)筛选力价最高的重组杆状病毒株为种病毒株； (4)使用该种病毒株感染家蚕； (5)养殖被感染的家蚕一段适当的时间让病毒进行复制，以产生出重组杆状病毒 并表现E2蛋白于体液中； (6)搜集被种病毒株感染的家蚕体液而得到重组E2蛋白，可作为猪瘟疫苗的抗 原。 本专利技术另外提供一种用于预防或是控制猪瘟病毒感染的猪瘟疫苗，其中该猪瘟疫 苗包括如上述方法所制备的重组猪瘟病毒E2蛋白与一可接受的佐剂。 附图简述 前文的所述以及实施方式可通过附图达到更好的说明效果。为了加强本专利技术的说 明，将适当的实施例的附图列举于此。要注意的是，本专利技术并不受限于列举于此的说明。 附图说明图1是E2次单位重组基因的质粒(pBpE2-his)的建构图。 图2是表示重组E2蛋白的浓度，其为以抗组氨酸抗体进行西方墨点法的结果。道 1至道8分别表示8只不同蚕体的体液，道9、道10与道11则为标准蛋白质含量的标示，其 分别表示50ng，200ng，400ng。 Y轴为蛋白的分子量标示，单位为kDa。 图3是表示重组E2蛋白的浓度，其为以抗组氨酸抗体与WH303抗体进行西方墨点 法的结果。道1至道5为E2蛋白两倍连续稀释后的结果(道1为1 : 1，道2为1 : 2，道3 为l : 4，道4为1 : 8，道5为1 : 16)。 〃 +〃号表示E2蛋白纯化后定量为136. 832ng/ P 1的浓度的结果。 图4为表示每剂量60 ii g的家蚕表现蛋白与不同佐剂混合，进行免疫效力评估的结果。X轴表示的为每隔两周采血的时间点，Y轴表示的为抗体稀释倍率。 图5为表示不同剂量抗原0-120 ii g与TW-W/0佐剂制成疫苗，进行免疫效力评估的结果。X轴表示的为每隔两周采血的时间点，Y轴表示的为抗体稀释倍率。 实施方式 本专利技术的主要目的为提供一种制备猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括 (1)选殖一重组猪瘟病毒E2基因于一适当载体中； (2)以该带有猪瘟病毒E2基因的载体与一家蚕杆状病毒(Baculovirus ;BmNPV) 的基因体共同转染家蚕细胞(BmN)，使其自然发生基因重组反应而得到带有E2基因的重组 家蚕杆状病毒； (3)筛选力价最高的重组杆状病毒株为种病毒株； (4)使用该种病毒株感染家蚕； (5)养殖被感染的家蚕一段适当的时间让病毒进行复制，以产生出重组杆状病毒 并表现E2蛋白于体液中；4 (6)搜集被种病毒株感染的家蚕体液而得到重组E2蛋白，可作为猪瘟疫苗的抗 原。家蚕杆状病毒为家蚕主要病害之一，该病毒特色为具有强力的启动子，可在 感染短短数天内制出大量的蛋白产物，其启动子所制造外源蛋白的量，可高达感染细胞的 20%以上。因此，家蚕蚕体可作为一个有效率且经济的蛋白生产平台，利用家蚕杆状病毒将 表达特定蛋白的转殖基因带入家蚕蚕体，利用家蚕蚕体进行转殖基因的增生及表现。此领 域的技术人员可根据所拟表达蛋白的需要，自行生产家蚕杆状病毒并修改其启动子。根据 本专利技术的一实施例，所使用的家蚕杆状病毒是由中央研究院分子生物所赵裕展博士以基因 重组方法改造及构筑，其中控制转录的BmNPV的polyhedrin启动子亦由赵博士于中央研究 院石开发(Wu and Chao， 2008， Biotechnology Progress, accepted)。 本文中所称的猪瘟病毒(Classic swine fever 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备造猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括：　　ａ）选殖一重组猪瘟病毒Ｅ２基因于一适当载体中；　　ｂ）以该带有猪瘟病毒Ｅ２基因的载体与一家蚕杆状病毒（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ；ＢｍＮＰＶ）的基因体共同转染家蚕细胞（ＢｍＮ），使其自然发生基因重组反应而得到带有猪瘟病毒Ｅ２基因的重组家蚕杆状病毒；　　ｃ）筛选力价最高的重组杆状病毒株为种病毒株；ｄ）使用该种病毒株感染家蚕；　　ｅ）养殖被感染的家蚕一段适当的时间让病毒进行复制，以产生出重组杆状病毒并表现猪瘟病毒Ｅ２蛋白于体液中；　　ｆ）搜集被种病毒株感染的家蚕体液而得到重组猪瘟病毒Ｅ２蛋白，可作为猪瘟疫苗的抗原。

【技术特征摘要】
一种制备造猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括a)选殖一重组猪瘟病毒E2基因于一适当载体中；b)以该带有猪瘟病毒E2基因的载体与一家蚕杆状病毒(Baculovirus；BmNPV)的基因体共同转染家蚕细胞(BmN)，使其自然发生基因重组反应而得到带有猪瘟病毒E2基因的重组家蚕杆状病毒；c)筛选力价最高的重组杆状病毒株为种病毒株；d)使用该种病毒株感染家蚕；e)养殖被感染的家蚕一段适当的时间让病毒进行复制，以产生出重组杆状病毒并表现猪瘟病毒E2蛋白于体液中；f)搜集被种病毒株感染的家蚕体液而得到重组猪瘟病毒E2蛋白，可作为猪瘟疫苗的抗原。2. 如权利要求l的方法，其中该猪瘟病毒为亚群组2. 1 (subgroup 2. 1)基因型病毒株。3. 如权利要求1的方法，其中该猪瘟病毒为TD/96/TWN株。4. 如权利要求l的方法，其中该重组猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列为包含包含猪瘟病 毒外鞘蛋白中El的20个C端氨基酸序列，及E2的342个N端至TM区域的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金城，赵裕展，吴登桢，邓明中，林育如，林碧秀，廖久熏，
申请(专利权)人：黄金城，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]