应用发酵生产L-苏氨酸的方法技术

本发明专利技术提供一种大肠杆菌变体，其是经过下述改性的大肠杆菌：（１）琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；（２）苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低；（３）天冬氨酸激酶、天冬氨酸－β－半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的细胞内活性增强；（４）导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因。其中所述的高丝氨酸合成酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸－β－半醛脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和苏氨酸脱氨酶分别源于大肠杆菌。本发明专利技术也提供一种发酵生产Ｌ－苏氨酸的方法，包括在合适的培养基中培养上述大肠杆菌变体，积累Ｌ－苏氨酸，然后从培养基中收集Ｌ－苏氨酸。

【技术实现步骤摘要】
应用发酵生产L-苏氨酸的方法
本专利技术涉及微生物工业。特别是涉及应用微生物发酵生产L-苏氨 酸的方法，以及用于该生产方法的基因工程菌。
技术介绍
苏氨酸是动物维持生长所必需的氨基酸，在以菜籽粕或大豆粕为 蛋白质主要来源的生猪低蛋白质日粮中，赖氨酸是第一限制性氨基酸， 苏氨酸是第二限制性氨基酸。L-苏氨酸广泛用于动物饲料和食品添加 剂，以及用作医学或药物学用途的流体和合成材料。L-苏氨酸是使用衍 生自野生型大肠杆菌、棒状杆菌属、杀雷氏菌(Serratia)、普罗威登 斯菌(Providencia)等的合成突变体以及它们的二氨基庚二酸、甲硫氨 酸、赖氨酸或异亮氨酸营养缺陷的合成突变体(日本专利申请公开号平 2-219582，申请人Microbiolo.Biotechnol.，以及韩国专利公开号 92-8365)。中国专利公开号85104604A公开了一种采用短杆菌属细菌 的a -氨基-(3-羟基戊酸(AHV)和S- (2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC) 双重抗性变异株生产L-苏氨酸的方法。韩国专利申请号90-22965公开 了一种L-苏氨酸生产菌株TF4076 (KFCC10718)，它是甲硫氨酸营养 缺陷型并且抗苏氨酸类似物(AHV: a-氨基-卩-羟基戊酸)、赖氨酸类 似物(AEC: S- (2-氨基乙基)-L-半胱氨酸)、异亮氨酸类似物(a-氨基丁酸)和甲硫氨酸类似物(乙硫氨酸)。在大肠杆菌中L-苏氨酸的合成路线主要是二氢吡啶-2,6-二羧酸一一一L-赖氨酸天冬氨酸一天冬氨酰磷酸一 / 琥珀高丝氨酸一L-甲硫氨酸/鱼高丝氨酸、,高丝氨酸磷酸一L-苏氨酸一L-异亮氨酸在大肠杆菌中，L-苏氨酸的合成从天冬氨酸开始，天冬氨酸在天冬 氨酸激酶I (AKI )催化下转变为天冬氨酰磷酸，经过还原最后生成 高丝氨酸。天冬氨酸激酶I (AKI)是一个多功能酶，从天冬氨酸到高丝氨酸的代谢均由AKI催化。AKI由thrA基因编码。高丝氨酸在 高丝氨酸激酶催化下磷酸化，磷酸化的高丝氨酸通过苏氨酸合成酶合成 L-苏氨酸。高丝氨酸激酶由thrB基因编码，而苏氨酸合成酶由thrC基 因编码。对苏氨酸的代谢调节，现在研究得比较清晰。在L-苏氨酸的代谢 过程中，thrA基因编码的AKI起决定作用。 一般大肠杆菌合成苏氨酸 的量有限，因为L-苏氨酸抑制AKI酶的活性，并通过苏氨酸-tRNAs 调节苏氨酸操纵子的转录。苏氨酸类似物可以用来筛选苏氨酸生产菌 种，如在a-氨基-P-羟基戊酸的抗性菌株中，thrA基因发生突变,突变基 因编码的AKI酶抵抗苏氨酸的反馈抑制，从而导致苏氨酸的积累。在 具有抗生素borrelidin抗性的大肠杆菌中，苏氨酸-tRNAs合成酶的构象 发生变化，大大降低了与苏氨酸的亲和力，使苏氨酸大量积累。限制苏氨酸大量合成的另一个主要因素来源于异亮氨酸，异亮氨 酸的合成以L-苏氨酸为原料。因此，如果其合成途径不切断，只能导 致异亮氨酸的积累，而L-苏氨酸含量不会增高；另一方面，异亮氨酸 对thrA基因的转录水平具有强烈的反馈抑制，高含量的异亮氨酸阻断 AKI酶的合成。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是通过改变菌种的代谢调节，寻找到一种能高 产苏氨酸的基因工程菌。为达到上述目的，本研究人员进行了不懈的努 力和勤奋的研究，结果成功地获得了经过下述改性的大肠杆菌(l)琥 珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性减弱；(2) 苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低；(3)天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、 高丝氨酸激酶、苏氨酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶的细胞内活性增 强；和/或(4)导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因。(下文也称"本 专利技术的细菌")优选的，本专利技术的细菌是包括上述所有改性的大肠杆菌；最优选 的，本专利技术改性的大肠杆菌是基因工程菌K21P3。在本专利技术中，术语"细胞内活性增强"表示与野生型菌株(例如5大肠杆菌BL21菌株)或亲本菌株(该菌株在本专利技术特定的组合中包括 所有酶的细胞内活性都没有增强的菌株)相比，细胞内的酶促活性增强， 还表示一种细菌具有一种野生型菌株或亲本菌株所没有的酶促活性。在本专利技术中，术语"细胞内活性降低"表示与野生型菌株或亲本菌 株相比，细胞内的酶促活性减弱。用于测定上述酶活性的方法是公知的， 并且，本领域技术人员可以方便准确地证实酶在细胞内的活性是增强或 是减弱。本专利技术的细菌是大肠杆菌，其中，高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二 羧酸合成酶的细胞内活性降低。高丝氨酸合成酶，或琥珀酰高丝氨酸合 成酶是催化高丝氨酸生成琥珀酰高丝氨酸的酶，是L-甲硫氨酸合成代 谢途径的关键酶。二氢吡啶二羧酸合成酶是催化天冬氨酸-P -半醛生成 二氢吡咬-2, 6-二羧酸的酶，是L-赖氨酸合成代谢途径的关键酶。降低 琥珀酰高丝氨酸合成酶和降低二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性，相 应的增加了 L-苏氨酸和L-异亮氨酸生成途径的代谢流，从而使L-苏氨 酸和L-异亮氨酸过量积累。在本专利技术的细菌中，高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶是 通过化学诱变和紫外诱变的方法使其在细胞内的活性降低。使用化学诱 变剂硫酸二乙酯(DES)和甲硫胺处理大肠杆菌，获得突变菌株，对突 变株进行培养选育，并进一步对它进行紫外诱变和组成型选育。通过对 选育后的突变株的发酵液离心，收集上清液，测定其苏氨酸的含量，最 后将源于大肠杆菌突变株的琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸 合成酶与源于大肠杆菌的野生型琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二 羧酸合成酶进行氨基酸序列对比分析，发现琥珀酰高丝氨酸合成酶的突变包括脯氨酸取代第61位的丝氨酸， 丝氨酸取代第107位的甘氨酸，组氨酸取代第165位的丝氨酸。二氢吡啶二羧酸合成酶的突变包括丙氨酸取代第44位的苏氨酸， 赖氨酸取代第55位的谷氨酸，组氨酸取代第65位的天冬氨酸。本专利技术的细菌是大肠杆菌，其中，苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降 低。苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸生成ct-酮基丁酸，再经过乙酰羟酸合成酶等，进一步生成L-异亮氨酸。苏氨酸脱氨酶是大肠杆菌中L-苏氨 酸的分解酶，它的编码基因是tdc。如果上述合成途径不切断，只能导 致异亮氨酸的积累，而苏氨酸的含量不高。苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低可通过Red同源重组技术敲除苏 氨酸脱氨酶基因实现。Red同源重组技术作为一种新型基因打靶技术， 可用于构建具有特定突变的基因工程菌，以改变生物代谢途径。Red同 源重组技术是将一段携带与靶基因两翼各有40-60bp同源序列的PCR 片段导入宿主菌细胞，利用入噬菌体Red重组酶(EXO， Beta, Gam 三种蛋白)的作用，使线性DNA片段与染色体的特定靶序列进行同源 重组，使靶基因被线性DNA片段置换下来。在本专利技术的细菌中，通过Red同源重组技术敲除苏氨酸脱氨酶的 基因或己知CadA基因，构建苏氨酸脱氨酶基因缺陷株(异亮氨酸缺陷 的大肠杆菌菌株)，从而使苏氨酸脱氨酶的细胞内活性降低。在本专利技术 的细菌中，利用代谢工程技术构建苏氨酸脱氨酶基因缺陷株(异亮氨酸 缺陷的大肠杆菌菌株)，有望降低L-苏氨酸的分解，积累L-苏氨酸， 促进菌体生长。运用PCR技术，扩增出两翼与苏氨酸脱氨酶基因的上 下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因的DNA片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌变体，其中琥珀酰高丝氨酸合成酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的细胞内活性降低。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王德辉，贾冬舒，杨传波，
申请(专利权)人：长春大成实业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]