生产L-赖氨酸的方法技术

在合适的培养基中培养本发明专利技术的细菌，以便产生并且在培养基中积累Ｌ－赖氨酸，然后从培养物中收集赖氨酸，所述本发明专利技术的细菌是一种埃希氏菌属细菌，（１）具有其Ｌ－赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的二氢吡啶二羧酸合成酶以及其Ｌ－赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的天冬氨酸激酶，（２）二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，（３）导入了二氨基庚二酸脱氢酶基因，或增强了四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性，其中，天冬氨酸－半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性增强。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及微生物工业。更具体地讲，本专利技术涉及通过发酵生产L-赖氨酸的方法，以及用于该生产方法的微生物。例如，对于埃希氏菌属细菌来说，在以下文献中业已披露了用其中的二氢吡啶二羧酸合成酶(DDPS)活性增强了的菌株生产L-赖氨酸的方法日本专利申请后期公开(Kokai)No.56-18596，US4,346,170和‘应用微生物学和生物技术’，15，pp.227-331(1982)。另外，韩国专利申请NO.92-8382中业已披露了通过用向其中导入了源于棒杆菌属细菌的DDPS的埃希氏菌属细菌生产L-赖氨酸的方法。另外，在国际公开NO.WO95/16042中披露了通过用一种质粒转化过的菌株生产L-赖氨酸的方法，所述质粒含有源于埃希氏菌属细菌的编码二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA，它具有使L-赖氨酸的反馈抑制作用脱敏的突变；编码其L-赖氨酸的反馈抑制已经脱敏的天冬氨酸激酶的DNA；编码二氢吡啶二羧酸还原酶的DNA；以及编码源于棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶的DNA。对于短杆菌属细菌来说，据国际公开NO.WO95/11985披露，通过增强细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的活性，可以提高L-赖氨酸产量。另外，在日本专利申请后期公开NO.60-87788和日本专利公开(Kokoku)NO.6-102028中分别披露了用仅仅增强了其磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的菌株生产L-赖氨酸的方法，和用仅仅增强了天冬氨酸-半醛脱氢酶活性的菌株生产L-赖氨酸的方法。在通过发酵进行的氨基酸工业生产中，生产是以大规模形式进行的。因此，即使是若干个百分点的产量提高，都可以产生显著的工业价值，并且，因此需要产量提高，而无论产量的提高如何。为了实现上述目的，本专利技术人进行了不懈地研究。结果，本专利技术人发现，如果具有特定特性的埃希氏菌属细菌的天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性增强，并且，如果在上述埃希氏菌属细菌中，除了上述酶之外一种或几种酶的活性增强的话，所述细菌的L-赖氨酸产量可以提高，并且，他们根据这些发现完成了本专利技术。就是说，本专利技术提供了第一方面，一种埃希氏菌属细菌，其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，其中，天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性增强；第二方面，一种埃希氏菌属细菌，其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，其中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶或天冬氨酸-半醛脱氢酶的细胞内活性增强；第三方面，一种埃希氏菌属细菌，其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，其中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的细胞内活性和天冬氨酸-半醛脱氢酶或天冬氨酸酶的细胞内活性增强(在下文中，上述三个方面的细菌被统称为“本专利技术的细菌”)。在本专利技术的细菌中，优选天冬氨酸-半醛脱氢酶和天冬氨酸酶的细胞内活性增强。另外，在本专利技术的细菌中，天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和天冬氨酸-半醛脱氢酶优选分别源于埃希氏菌属细菌，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶和天冬氨酸酶(如果有的话)优选分别源于埃希氏菌属细菌，二氢吡啶二羧酸合成酶优选源于埃希氏菌属细菌或短杆菌属细菌，而二氨基庚二酸脱氢酶优选源于短杆菌属细菌。在本专利技术的细菌中，它的细胞内酶活性是通过下面的各项中的一项或其任意组合而增强的。(1)导入具有所述酶的基因的质粒。(2)增加染色体上所述酶的基因拷贝数量。(3)改变染色体上所述酶的基因的启动子序列。另外，在本专利技术的细菌中，优选通过获得其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的二氢庚二酸合成酶以及其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的天冬氨酸激酶，来增强二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的细胞内活性，并且，通过导入二氨基庚二酸脱氢酶基因，来增强二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性。本专利技术还提供了生产L-赖氨酸的方法，该方法包括在合适的培养基中培养本专利技术的任何细菌，以便产生并且在培养基中积累L-赖氨酸，以及从培养物中收集赖氨酸(以下又称之为“本专利技术的生产方法”)。附图说明图1表示源于RSF1010的质粒RSF24P的制备过程，它含有dapA*24。图2表示含有dapA*24和lysC*80的质粒RSFD80。图3表示含有dapA*24，lysC*80和dapB的质粒pCAB1。图4表示含有dapA*24，lysC*80，dapB和ddh的质粒pCABD2。图5表示含有dapA*24，lysC*80，dapB，dapD和dapE的质粒pCABDE1。图6表示含有ppc的质粒pppc的结构。图7表示含有asd的质粒pasd的结构。图8表示含有pntAB(pntA和pntB)的质粒pMW∷THY的制备过程。图9表示含有aspA的质粒pMW∷aspA的制备过程。图10表示含有ppc和asd的质粒ppcd的制备过程。图11表示含有ppc和pntAB的质粒pPTS的制备过程。图12表示含有ppc和aspA的质粒pAPW的制备过程。图13表示含有ppc，pntAB和asd的质粒pPTd的制备过程。图14表示含有ppc，pntAB和aspA的质粒pAPT的制备过程。图15表示含有ppc，pntAB和aspA的质粒pAPTK的制备过程。图16表示含有asd的质粒pSd的制备过程。图17表示含有ppc，pntAB，aspA和asd的质粒pKD的制备过程。图18表示含有tetpro的质粒pUTES的制备过程。图19表示含有tepro和位于tetpro下游的、源于乳发酵短杆菌的dapA质粒pUEBL3的制备过程。图20表示含有源于乳发酵短杆菌的dapA(Brev.dapA)、lysC、dapB和ddh的质粒pCABD(B)的制备过程。实施本专利技术的最佳方式<1>本专利技术的细菌本专利技术的细菌是埃希氏菌属细菌，其中(1)二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2)二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，并且，以下酶的细胞内活性增强(1)天冬氨酸-半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，(2)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶(以下又称之为“转氢酶”)或天冬氨酸-半醛脱氢酶，或(3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，转氢酶，天冬氨酸-半醛脱氢酶或天冬氨酸酶。本专利技术的细菌优选是埃希氏菌属细菌，其中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，转氢酶，天冬氨酸-半醛脱氢酶和天冬氨酸酶的细胞内活性进一步增强。本专利技术的细菌优选属于大肠杆菌。在本说明书中，短语“细胞内活性增强”表示与野生型菌株(例如，大肠杆菌W3110菌株)或亲本菌株(该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种埃希氏菌属细菌，其中（１）二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和（２）二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，其中，天冬氨酸－半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性增强。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：中西一夫，菊池庆实，小岛淳一郎，铃木智子，西村康史，児岛宏之，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]