一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。本发明专利技术提供的辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒，包括针对ＭＡＧＥＣ１／ＣＴ７基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列１和序列表的序列２所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列３所示。本发明专利技术的试剂盒，不仅可以应用于定性诊断多发性骨髓瘤ＭＡＧＥＣ１／ＣＴ７基因的表达，还可以通过内参基因，诊断多发性骨髓瘤ＭＡＧＥＣ１／ＣＴ７基因的表达水平。本发明专利技术为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明专利技术将在医学检测领域发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。
技术介绍
多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是浆细胞的恶性肿瘤，其特征为骨髓中异常浆细胞恶性增殖，血清或尿中出现过量单克隆免疫球蛋白(IgG，IgA，IgD或IgE)或BenceJones本周蛋白质(游离的单克隆性k或Y轻链)，常伴有多发性溶骨性损害，高钙血症，贫血，肾脏损害，易引起肺部、泌尿系感染。在我国多发性骨髓瘤的发病率占血液系统肿瘤的第二位，中位生存期为3 5年。目前，多发性骨髓瘤的治疗主要包括常规化疗、干细胞移植以及新型药物治疗，如免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂等的应用，虽然可以使病情得到有效控制，但很少有患者能够取得完全缓解甚至治愈。越来越多的证据表明多发性骨髓瘤细胞的基因异质性很大程度上决定了不同的临床后果。 现在多发性骨髓瘤的诊断已经从单纯细胞形态学诊断演变为细胞生物学和临床医学结合的综合诊断模式。常规诊断技术有各种电泳、免疫组化、流式细胞术、PCR检测免疫球蛋白重链或轻链基因的克隆性重排等，但一直以来，缺乏多发性骨髓瘤特异的诊断、预后分子标记和治疗监测的分子靶标，使对治疗多发性骨髓瘤的疗效难以作出更科学的评估。 癌睾丸抗原(Cancer testis antigen, CT抗原)是一种免疫原性蛋白质，在过去15年间已鉴定了 40多个家族，基于其在肿瘤患者中的特异性表达和免疫原性，CT抗原已被认为是有应用前景的人类恶性肿瘤免疫治疗的靶标，并有可能成为重要的诊断和预后标志。新近的研究发现匪患者中高频率表达CT抗原，且可诱导抗体介导和T细胞介导的免疫反应。异基因干细胞移植的治疗效果一部分是由供者来源的T细胞显示的免疫效应的结果，针对CT抗原的免疫反应，提示CT抗原可能是供者来源同种异体免疫甚至是自发抗骨髓瘤免疫应答的天然靶标。骨髓残留恶性浆细胞的匪患者明显持续表达CT抗原，所以CT抗原是针对微小残留病的有潜力的标志，还可以用于靶向治疗后残存于患者骨髓中的骨髓瘤细胞。通过检测骨髓浆细胞的数量和外周血异常蛋白水平，已发现CT抗原表达水平和骨髓瘤患者的临床病程间有强相关性，CT抗原可能不仅是独立的肿瘤标志，而且是早期复发和生存率显著下降的重要指标。MAGECl/CT7(黑色素瘤抗原-Cl/癌睾丸抗原7)是匪中最常见的一种CT抗原表达，检测阳性率可达65% 82% ，在肿瘤细胞中高表达，在正常细胞中不表达，MAGEC1/CT7的肿瘤特异性的高频率且持续的表达，使其最有可能成为有效的匪诊断、预后、疗效监测指标及免疫治疗靶标。 目前，国际上已报道的用于检测MAGEC1/CT7表达的方法主要为定性PCR和免疫组织化学方法，这些方法普遍存在灵敏度低、特异性不高、费时费力等缺点，使应用受到一定限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。 本专利技术提供的辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒，包括针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。 所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有MAGEC1/CT7基因或其片段的重组质粒。所述阳性质粒可为含有序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段的重组质粒。所述阳性质粒具体可为将pMD18-T载体与序列表的序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段连接得到的重组质粒。 所述试剂盒可还包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为ABL基因。所述特异性引物对乙具体可为序列表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列具体可如序列表的序列6所示。 所述试剂盒还可包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质粒。所述内参质粒可为含有序列8所示的ABL基因片段的重组质粒。所述内参质粒具体可为将pMD18-T载体与序列表的序列8所示的ABL基因片段连接得到的重组质粒。 本专利技术还保护针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲在制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列l和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。 在多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因表达，而在正常人的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因不表达。且处于不同ISS期的多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因的表达水平具有差异性。本专利技术的试剂盒，不仅可以应用于定性诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者MAGEC1/CT7基因的表达水平。本专利技术为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本专利技术将在医学检测领域发挥重要作用。附图说明 图1为实施例3中阳性对照质粒灵敏度检测的RQ-PCR荧光曲线。 图2为实施例5中阳性对照质粒RQ-PCR扩增的标准曲线；显示Ct值和阳性对照质粒不同稀释度的样本间呈线性相关(相关系数> 0. 99)。 图3为实施例5中内参对照质粒的RQ-PCR扩增的标准曲线；显示Ct值和内参对照质粒不同稀释度的样本间呈线性相关(相关系数> 0. 99)。 图4为实施例6中，25位患者的骨髓中浆细胞数占骨髓有核细胞的百分比和MAGEC1/CT7基因表达水平的关系。 图5为实施例6中，31位患者的骨髓中0038+/00138+细胞占骨髓有核细胞的百分比和MAGEC1/CT7基因表达水平的关系。 图6为实施例6中，将31位患者的骨髓中CD38+/CD138+细胞占骨髓有核细胞的百分比按< 1% (1组，n = 9)、1% -10% (2组，n = 14)、> 10% (3组，n = 8)分为三组时，各组MAGEC1/CT7基因表达水平。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 实施例1、特异性引物对和探针的设计 针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲(扩增产物为79bp)和探针甲 上游引物MAG-FP : 5' -TTGTCTTCTGGGAACCTTGACTC-3'; 下游引物MAG-RP : 5' -TGAGGGACACATACATCCTAAAAGC-3';探针MAG-T-probe :FAM-ACTGCCTGGGCCTCCTCTGCTGT-BHQ(5' -3，)。 针对ABL基因(内参基因)的特异性引物对乙和探针乙 上游引物ENF 1003 :5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3'; 下游引物ENR1063 :5' -GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，；探针ENPrl043 :FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(5， -3，)。 针对ABL基因的特异性引物对乙和探针乙按参考文献合成(Gabert J，BeillardE， van der Velden VH， et al. 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒，包括针对ＭＡＧＥＣ１／ＣＴ７基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列１和序列表的序列２所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列３所示。

【技术特征摘要】
一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒，包括针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。2. 如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性质粒；所述阳性质 粒为含有MAGEC1/CT7基因或其片段的重组质粒。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为含有序列7所示的 MAGEC1/CT7基因片段的重组质粒。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为将pMD18-T载体与序列 表的序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段连接得到的重组质粒。5. 如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括针对内参 基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为ABL基因。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：阮国瑞，黄晓军，张瑶，刘开彦，陈欢，江滨，陈珊珊，鲍立，李金兰，刘艳荣，史惠琳，牛继红，秦亚溱，李玲娣，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]