测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱方法技术

本发明专利技术是一种测定竹红菌甲素（Ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ？Ａ）含量的高效液相色谱（ＨＰＬＣ）方法。液相色谱条件为：色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇－稀磷酸（或稀甲酸、稀乙酸、稀硫酸）组成的混合溶剂，甲醇与稀磷酸（或稀甲酸、稀乙酸、稀硫酸）的体积比为８０∶２０～７０∶３０，检测波长４６２ｎｍ。本发明专利技术克服了已有分析方法的缺陷，可直接应用于含竹红菌甲素的中药材以及制剂中竹红菌甲素的定量分析。该方法具有分离效果好，测定准确、灵敏，专属性强，测定快速等技术特点。含竹红菌甲素的药材、制剂中竹红菌甲素的吸收峰可在３０分钟内全部流出色谱柱，完成分析工作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物分析
，具体是一种测定竹红菌甲素(Hypocrellin A)含 量的高效液相色谱(HPLC)方法。
技术介绍
光动力疗法(Photodynamic Ther即y， PDT)是一种新型临床治疗技术，其发展始于 20世纪70年代用于肿瘤的临床诊断和治疗研究，随着对其作用机制的深入了解，在90年代 开始用于治疗鲜红斑痣、微血管类疾病、视网膜黄斑变性等。从1993年加拿大首先批准光 敏药物Photofrin应用于膀胱癌和食管癌的光动力治疗以来，光动力疗法在很多国家获得 批准，众多病人受益于光动力疗法。 作为一种新型疗法，PDT是将光敏剂导入体内并让它在组织间分布，然后用与光敏 剂吸收光谱相匹配的光照射靶组织，在氧的参与下产生对靶组织的破坏。PDT的关键在于光 敏活性化合物的获得以及光的参与，并因而获得双重选择性，也因选择性的获得而在临床 治疗上具有高效性和安全性。 竹红菌甲素(Hypocrellin A， HA)是从云南民族药竹红菌(竹生小肉座菌 Hypocrellabambusae的干燥子座]中首先发现的一种菲醌类新型天然光敏剂，其化学结构 如附图l所示(万象义等，一种新的光化学疗法药物一竹红菌甲素，科学通报，1980年第 24期，1148页；Tadashi Kish et al，New Perylenequinones from Shiraia bambusicola， Planta Med， 1991年，第57巻，376页)。 HA的光敏活性具有光毒性高、暗毒性低、易排泄等优点，以其为主要有效成分开发的民族药制剂竹红菌软膏，在临床上已用来治疗外阴白色病变、软化疤痕疙瘩、鲜红斑痣等，是一种具有发展前景的新型光疗药物(徐尚杰等，新型光动力药物 一 竹红菌素衍生物的研究与进展，科学通报，2003年第10期，1005页；魏玉德，竹红菌素研究的进展，中国实用医药，2008年第3期，147页)。 有关HA定量分析的研究，主要有 (1)分光光度法利用HA在紫外-可见光区具有吸收的性质，以测定其吸光值来 定量。因发色团相似的化合物均具有类似吸收曲线，该方法容易受杂质，尤其是同类物质的 干扰，专属性差，已不适应药物分析的实际需求。 (2)高效液相色谱法利用色谱柱先将HA和其它成分分离，再利用其理化性质检 测含量，是目前主流的分析技术，有以下的报道 ①专利技术专利"高效液相色谱法测定竹红菌甲素含量的方法"(专利号 ZL200410065986. 7)和论文"高效液相色谱荧光检测法测定竹红菌中竹红菌甲素的含 量"(顾晓天等，药物分析杂志，2006年，第1期，68页)用甲醇-水=83 : 17为流动相分 离，以荧光发射性质检测进行定量分析。 ②论文"HPLC法测定光疗药物竹红菌乙素的含量"(安红波等，黑龙江八一农垦大 学学报，2009年，第3期，70页)用甲醇-水=83 : 17为流动相，在300nm处检测紫外吸收进行定量分析。 ③论文"竹红菌中竹红菌乙素的提取及其含量的测定"(周林，南京师范大学学报， 2007年，第2期，122页)用乙腈-KH2P04(0 . 02mmol/L) = 70 : 30为为流动相，在300nm处 检测紫外吸收进行定量分析。 但经过本专利技术人系统的研究，结果表明上述专利或论文所确定的主要技术条件有 严重缺陷，在实际的生产应用中，存在这以下弊端 (1)所选用的流动相甲醇-水=83 : 17，或者乙腈-KH2P04 (0 . 02mmol/L)=70 : 30，均不能很好分离样品中HA，图谱中HA峰倾斜，对称度达不到《中国药典》2005年版一部附录VI D对于HPLC分析拖尾因子在0. 95 1. 05之间的要求。 (2)上述方法①采用的荧光检测器，为不常用仪器，适用面窄。方法①中专利技术只选用双封端保证很低硅羟基活性的Zorbax Extend C18柱，适用面窄，且此类色谱柱一般价格较高，增加了分析成本。 (3)上述方法②、③采用在300nm处检测紫外吸收，而HA的紫外-可见吸收曲线(如附图2所示)在300nm不是吸收峰，不适宜用作定量分析的检测波长。 为寻求对于HA更科学合理，更具有适用性的药物分析方法，本专利技术人经过系统的对比研究，提供了一种不同于上述专利或论文所公布的，可用于测定中药材或者其制剂产品中HA含量的HPLC方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为准确地分析测定中药材及其制剂中HA的含量，更好地控制药品质量，保障临床用药安全有效，提供一种。 本专利技术通过以下的技术方案实现 1. HPLC分析检测方法和检测波长的确定 HA在紫外_可见区有吸收(附图2)，可用紫外_可见检测器直接检测，这也是最常 用、最普及的检测方法和仪器，考虑到应用普遍性，优先采用此检测方法。适量HA溶解于甲 醇或HPLC流动相中，制成约lmg/100mL的溶液，用分光光度计在200 800nm波长范围内 扫描紫外_可见光谱，结果表明HA吸收曲线有6个吸收峰(附图2) :581. 0、540. 5、462. 0、 342. 5、266. 5、231. Onm，其中以462nm处的吸收峰干扰少且较平坦，随后的HPLC分析也明 确，在此检测波长下的HPLC图谱没有杂质干扰，故此确定用紫外检测法，检测波长462nm。 2. HPLC分析色谱柱的选择 十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(C-18柱)是HPLC分析最常用、性价比最高的色 谱柱系列，考虑到应用普遍性，比较了不同厂牌、型号C-18柱(大连依利特公司C-18柱， Phenomenex公司C-18柱、Merck公司C-18柱)的分离效果，结果表明在本专利技术分析条件 下，对中药材及制剂中HA的含量分析没有明显区别，均能很好的实现定量分析。因此确定 选用以碳十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱。 3. HPLC分析流动相的筛选 选择合适的流动相以得到良好分离效果是HPLC分析的关键，基于一般的公知事 实和工作经验，在HPLC分析中最常用的溶剂有甲醇、乙腈等，调节流动相酸碱性的常用试 剂有磷酸、甲酸、二乙胺、三乙胺等。根据理化性质和经验，选择甲醇-水、乙腈-水系统为基础，辅以磷酸等调节酸性来对比筛选分析中药材及其制剂中HA含量的流动相组成和配比。 筛选选用Phenomenex公司C-18柱(①4. 6X 150mm， 5 y m，使用pH范围为1.5 IO)，流速 1. 0ml/min ;柱温30°C ;检测波长642nm。对比研究数据及其分析结果见表一。 表一 HA含量HPLC分析的流动相对比筛选试验评价结果 <table>table see original document page 5</column></row><table><table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table> 结果表明流动相以甲醇-稀磷酸(或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定竹红菌甲素含量的高效液相色谱（ＨＰＬＣ）方法，其特征是ＨＰＬＣ条件为：色谱柱以碳十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇－稀磷酸或甲醇－稀甲酸或甲醇－稀乙酸或甲醇－稀硫酸组成的混合溶剂，甲醇与稀磷酸或稀甲酸或稀乙酸或稀硫酸的体积比为８０∶２０～７０∶３０，检测波长为４６２ｎｍ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑立雄，张慧颖，李俊，饶高雄，
申请(专利权)人：昆明振华制药厂有限公司，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]