一种嗜酸乳杆菌Ｓ－层蛋白表面展示系统的构建，属于生物技术领域，其特征是：基因的获得，（１）ＰＣＲ扩增，（２）ＳｌｐＡ基因与ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ系统连接，（３）克隆质粒ｐＭＤ１８Ｔ－Ｓ的鉴定。构建，（１）目的基因和双标记表达载体的获得，（２）双标记表达载体与ＳｌｐＡ的连接转化，（３）表面展示载体系统鉴定，（４）Ｓ－层蛋白在重组体表面锚定表达情况检测。其有益效果是：１．所构建的载体可以用于转化入Ｓ－层蛋白基因缺陷的乳酸菌内来研究乳酸菌Ｓ－层蛋白形成的机制。２．利用ＤＮＡ重组技术，将病原体的保护性抗原基因与该表面展示载体上的乳酸菌Ｓ－层蛋白相融合。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
技术介绍
1微生物细胞表面展示技术微生物细胞表面展示(Microbial cell-surface display, MCSD)是指利用分子生物学技术和 免疫学等技术将外源保护性肽类分子和蛋白质分子锚定展示在微生物细胞表面，即将外源蛋 白与菌体的某一表面蛋白相融合，借助菌体蛋白的表面识别和表面定位功能将前者定位在细 胞表面，前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白，这样表达出的基因产物不需进行提取、纯 化，复性等操作，可以直接利用全细胞进行表达出蛋白的后续工作[1]。2表面展示系统的研究现状2.1噬菌体表面展示系统噬菌体表面展示技术(phage display)是由Smith于1985年首先建立起来的一种新的 生物技术[2]，它能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，保持相 对独立的空间构象和原有的生物活性[3]。该项技术比较成熟，已成功地用于抗原表位筛选， 酶抑制剂和受体拮抗剂分离，细胞信号转导途径以及抗体工程研究等。常用的噬菌体表面展 示系统主要有丝状噬菌体、X噬菌体及T4噬菌体展示系统等。虽然它们都具有噬菌体展示 系统的优点，但对亍丝状噬菌体来说，它不能展示那些难以分泌的肽和蛋白质，而且它的N 端可融合外源多肽的容量有限，较大蛋白的融合会造成空间障碍，影响噬菌体的装配，使其 失去感染力。而对于人噬菌体，大分于蛋白的融合会抑制噬菌体的组装，使其生长受到影响， 因此这两种噬菌体更适用于构建短肽库和cDNA表达文库[4]，而不适于构建重组疫苗和表达 分子量大具有完整结构域的蛋白质[5夂71 。2.2细菌表面展示系统细菌表面展示系统是继噬菌体表面展示系统之后发展起来的，其呈现载体多样，可根据 不同需要呈现蛋白或多肽。近年来其应用已扩展到重组细菌疫苗，多肽库筛选，全细胞吸附 齐lj，全细胞催化剂以及作为诊断的细胞固相试剂等多个领域。目前有多种细菌表面展示系统可供利用，除了以往对细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位如鞭毛、菌毛等研究 较多外，近几年又开发出多种新的表面展示系统。研究较多的有冰晶核蛋白、自体转运蛋白 S-层蛋白等。此外，尚有研究利用枯草杆菌的芽胞外膜，L-型大肠杆菌和变形杆菌的细胞膜 来展示外源蛋白。每种展示系统都有其自身的缺点，例如展示蛋白大小的限制，错误定位， 形成包涵体，外膜不稳定等，因此需要开发新的系统，以进一步优化表面展示系统CT。2.3酵母表面展示系统酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立后发展起来的真核展示系统，酵母表达体系 不但有原核表达体系的特点，同时具有真核细胞翻译后蛋白加工修饰的过程，酵母的蛋白质 折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示更具优越性。将酶，抗 原，抗体和六聚组氨酸等不同蛋白和多肽展示在酵母细胞表面，可实现各种各样的用途。酵 母细胞颗粒大大可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以a或a 凝集素作为融合骨架。在蛋白质的定向进化、口服疫苗的研制等多方面均有报道。酵母表 面展示技术的发展非常迅速，同时，在不断地完善和改进，应用于越来越多的领域。由于其 具有转录后修饰，有效的空间折叠蛋白的优势，使之对真核生物蛋白展示具有独特的优势。 但同时也存在许多不利因素，如重组酵母缺少选择性标记，生长调节苛刻；如果配体对细胞 有毒性作用，有可能导致酵母死亡，无法得到目的克隆P]。3 S-层蛋白及其在微生物表面展示系统中的应用3.1S-层蛋白的发现、定位和超微结构许多古细菌和真细菌在原生质外层都具有一层非常重要的细胞外壁结构，称为表面层(Surface layers),由单一的蛋白质或糖蛋白亚单位组成，在菌体表面自我装配形成规则晶格的单分子层，又称S-层蛋白质(S-layerprotein),它与位于其下方的细胞包被(细胞膜、外膜或细胞壁)以非共价键方式连接，完整的包裹着细菌菌体，是生物进化过程中最简单的一种生 物膜叫m。由于细菌外壁结构的不同，S-层与其它细胞表层结构之间的关系较复杂，在研究比较多 的古细菌中S-层能与原生质末紧密连接在一起从而被整合到质脂双分子层中。根据国内外的 研究报道，S-层在原核生物的存在状况可分三种情况在革兰氏阴性(G-)古细菌中，外鞘 结构最简单，由细胞膜和S-层组成，S-层紧贴在细胞膜外则作为细胞壁成分直接与细胞膜相 连；革兰氏阳性(G+)古细菌和真细菌的S-层蛋白与肽聚糖层相连，存在于细胞壁外面；G-真 细菌的S-层存在于外膜的外层，其外鞘结构依次为细胞膜、肽聚糖层、外膜和8-层[12，13]。对 于有荚膜和S-层的细菌，荚膜存在于s-层外面ti。在真细菌和古细菌中，S-层可在细胞生长和分裂的所有阶段完全覆盖在细胞表面。过去， S-层的广泛存在并不被人们所关注，因为实验室条件下S-layers比较脆弱，而且可能随培养时间的延长而丢失，所以对其形态学的研究有较大难度，目前较多的应用切片技术(thinsections)、冷冻蚀刻技术、电子负染技术和重结晶技术等来进行菌体表面形态的观察[151。最近，随着显微镜技术的提高，人们得到了清晰度分辨率更高的S-层蛋白的电子图像，许多图像显示了亚单位通道动态的开放与闭合[16]。独立存在的表层蛋白在溶液中或者在细胞表面上具有再结晶的能力[171,目前对该能力研究比较多的表层蛋白主要来源于芽孢杆菌科的某些种类。S-层的晶格结构为倾斜形、四方形或六角形，在这些晶格中S-层亚单位是对齐并对称排列的，在古细菌中大多数是以六角形对称排列。这些形态学单位相邻最近两个中心间距为2.5 35nm。因此S-层是多孔的网状结构，其孔隙占据了整个表面积的30 % 70 %，同一S-层中孔隙的大小和形状是相同的， 一般在2 8nm这个范围内。3.2 S-层蛋白的化学成分和组成对多种s-层蛋白质的化学分析和遗传研究指出无论是在哪种细菌中，s-层蛋白的组成相似，由单一的蛋白质或糖蛋白亚单位组成，分子量在40.0到170.0kD之间一般疏水性氨基酸占40% 60%，含有大量谷氨酸和天冬氨酸(15%)，赖氨酸的含量也相当高(10%)，极少存在含硫氨基酸。20%的氨基酸构成01螺旋，40%为卩折叠，非周期性的折叠和卩-转角在5% 45%之间。 一般情况下，S-层蛋白的等电点在4 6，也有报道表明许多乳酸杆菌的等电点很高，个别为8 10。许多古细菌和G+细菌的S-层蛋白被糖基化，可与糖链共价结合，糖链一般由含中性己糖、戊糖、庚糖、6-脱氧己糖和氨基糖的20 50个重复单位组成。在有些S-层蛋白中还有磷酸化修饰作用[18]。3.3S-层蛋白的分子生物学，遗传学和生物合成克隆和序列分析s-层蛋白基因的研究，为人们对s-层的遗传学和生物合成带来了许多新的了解，虽然组成s-层的氨基酸组成没有明显的差别，但不能反映基因序列的真实情况，古细菌和真细菌基因序列的同源性小，在亲缘关系相近的细菌中时常可以发现同源基肉，如嗜酸乳杆菌ATCC4356和瑞士乳杆菌编码S-层蛋白基因的同源性高达80。/。，而短乳杆菌与前两者的同源性却很低。对于一个中等大小的杆状细胞来说，完整的S-层大约由5xlOS个单体组成，因此为了维持S-层在细胞表面的存在，对于代时为20 3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嗜酸乳杆菌Ｓ－层蛋白表面展示系统的构建，其特征是： ａ、嗜酸乳杆菌Ｓ－层蛋白ＳｌｐＡ基因的获得 （１）ＳｌｐＡ基因的ＰＣＲ扩增 将复苏的嗜酸乳杆菌菌种采用染色体提取试剂盒，按说明书操作提取染色体ＤＮＡ；根据已发表Ｓ－层基因的序列， 设计了一对引物，在引物的５’端和３’分别加有酶Ｓａｃ Ｉ和Ｋｐｎ Ｉ酶切位点；用Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶以染色体ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增目的基因；引物的设计：根据已发表的Ｓ－层蛋白基因序列设计引物； Ｐ１：５’ ＧＧＣ ＧＡＧＣＴＣ ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴ ３’ Ｓａｃ Ｉ Ｐ２：５’ ＧＴＧ ＧＧＴＡＣＣ ＴＴＡＴＣＴＡＡＡＧＴＴＴＧ ３’ ＫｐｎＩ （２）ＳｌｐＡ基因与ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ系统连接 将回收产物与载体初步定量，设计连接反应体系， 在０．５ｍＬ离心管中加入ＰＣＲ纯化产物４μＬ，ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ １μＬ，Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ ５μＬ，混匀，１６℃连接２ｈ后，转化大肠杆菌ＪＭ１０９感受态细胞； （３）克隆质粒ｐＭＤ１８Ｔ－Ｓ的鉴定 将转化后的细胞取１０ ０－２００μｌ菌液涂布于准备好的ＬＢ－ＡＭＰ琼脂平板（含２００μｇ／ｍｌ ＡＭＰ，２０％Ｘ－ｇａｌ和４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ）３７℃培养过夜；蓝白斑筛选出转化子，酶切及ＰＣＲ鉴定后，送至ＴＡＫＡＲＡ公司测序，序列测定后应用ＤＮＡＳｔａｒ软件进行分析，将阳性转化子命名为ｐＭＤ１８Ｔ－Ｓ； ｂ、表面展示系统ｐＷ４２５ｅｔ－Ｓ的构建 （１）目的基因ＳｌｐＡ和双标记表达载体ｐＷ４２５ｅｔ的获得 将双标记表达载体ｐＷ４２５ｅｔ和克隆质粒ｐＭＤ１８Ｔ－Ｓ质粒用ＳａｃＩ和ＫｐｎＩ限 制性内切酶进行酶切，以获取粘末端的ｐＷ４２５ｅｔ载体及ＳｌｐＡ基因片段；酶切完毕后，进行１％琼脂糖凝胶电泳，用维特洁回收纯化试剂盒回收纯化，以用于下一步连接； （２）双标记表达载体ｐＷ４２５ｅｔ与ＳｌｐＡ的连接转化 将回收纯化后具有粘末 端的ＳｌｐＡ基因及ｐＷ４２５ｅｔ载体片段，按照一定的比例加入到０．５ｍＬ离心管混匀后，同时设空载体对照组（所加ＳｌｐＡ片段用双蒸水替代），经Ｔ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ在１６℃连接２ｈ，４℃过夜；将连接产物１０μＬ转化到１００μＬ感受态细胞Ｘ１３中，同时向另１００μＬ感受态细胞中加入１０μＬ灭菌双蒸水，作为阴性对照，加入５μＬ没有进行酶切的ｐＷ４２５ｅｔ质粒作为阳性对...
【技术特征摘要】
1、一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白表面展示系统的构建，其特征是a、嗜酸乳杆菌S-层蛋白SlpA基因的获得(1)SlpA基因的PCR扩增将复苏的嗜酸乳杆菌菌种采用染色体提取试剂盒，按说明书操作提取染色体DNA；根据已发表S-层基因的序列，设计了一对引物，在引物的5’端和3’分别加有酶Sac I和Kpn I酶切位点；用Ex Taq DNA聚合酶以染色体DNA为模板进行PCR扩增目的基因；引物的设计根据已发表的S-层蛋白基因序列设计引物；P15’GGC GAGCTCATGAAGAAAAATTT 3’Sac IP25’GTGGGTACCTTATCTAAAGTTTG 3’KpnI(2)SlpA基因与pMD18-T Vector系统连接将回收产物与载体初步定量，设计连接反应体系，在0.5mL离心管中加入PCR纯化产物4μL，pMD18-T Vector 1μL，Ligation Mix 5μL，混匀，16℃连接2h后，转化大肠杆菌JM109感受态细胞；(3)克隆质粒pMD18T-S的鉴定将转化后的细胞取100-200μl菌液涂布于准备好的LB-AMP琼脂平板(含200μg/ml AMP，20％X-gal和40mmol/L IPTG)37℃培养过夜；蓝白斑筛选出转化子，酶切及PCR鉴定后，送至TAKARA公司测序，序列测定后应用DNAStar软件进行分析，将阳性转化子命名为pMD18T-S；b、表面展示系统pW425et-S的构建(1)目的基因SlpA和双标记表达载体pW425et的获得将双标记表达载体pW425et和克隆质粒pMD18T-S质粒用SacI和KpnI限制性内切酶进行酶切，以获取粘末端的pW425et载体及SlpA基因片段；酶切完毕后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，用维特洁回收纯化试剂盒回收纯化，以用于下一步连接；(2)双标记表达载体pW425et与SlpA的连接转化将回收纯化后具有粘末端的SlpA基因及pW425et载体片段，按照一定的比例加入到0.5mL离心管混匀后，同时设空载体对照组(所加SlpA片段用双蒸水替代)，经T4...
【专利技术属性】
技术研发人员：王春凤，李景梅，刘琼，田坚，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
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