本发明专利技术涉及一种动物源细菌对β－内酰胺类药物耐药基因三重ＰＣＲ检测技术，该方法包括扩增待测细菌耐药基因的三对ＰＣＲ引物以及ＰＣＲ模板制备试剂和细菌耐药基因多重ＰＣＲ扩增试剂。较传统药敏试验，该多重ＰＣＲ方法将检测时间从３－４天缩短至１天内完成。病原菌经常含有多种β－内酰胺酶基因，而该技术满足了同时检测多种基因的需求，提高了检测的准确性和特异性。该技术可用于检测临床分离菌中三种β－内酰胺类药物耐药基因。
【技术实现步骤摘要】
一种动物源细菌对3 -内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术 [专利
j本专利技术涉及动物源细菌8-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术，属于医学分f生物学领域，具体是关于动物源细菌对e-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术方法及 其在耐药性检测中的应用。B-内酰胺类药物(B-lactam antibiotics)是指化学结构中具有B-内酰胺环的一大类抗生 素，根据B-内酰胺环侧链的改变将其分为青霉素类、头孢菌素类、头,素类、单环内酰胺 类和非典型B-内酰胺类药物。青霉素(penicillin)于1928年被Fleming发现，并于1939年 被Horey禾口 Chain提纯，随后开始应用于临床，成为临床上使用最早、用量最大的一种抗 生素，丌启了一个伟大的抗生素时代。头孢菌素类抗生素于20世纪60年代应用于临床， 具有抗菌作用强、耐青霉素酶、临床疗效高、毒性低、过敏反应较青霉素类少等优点，尤 其是第三代头孢菌素对革兰阴性杆菌的抗菌活性强，为目前应用最广的一类B-内酰胺类药 物。世界卫生组织(WHO) 2003年统计数据表明B-内酰胺类药物的使用量分别占动物源、 人源抗生素使用总量的约30%、 40%。我国这一比例更是达到30%-70%。B-内酰胺类药物主要作用机制是与细菌细胞膜上青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins, PBP)结合，抑制细菌肽聚糖的合成，使细菌无法形成坚韧的细胞壁，导致细菌 死亡；而哺乳动物真核细胞无细胞壁，故不受影响。自B-内酰胺类药物应用于临床伊始， 细菌对该类药物的耐药性便随之产生。90年代以来，几乎所有的B-内酰胺类药物均有相应 的水解酶出现并导致细菌耐药。近年来，B-内酰胺类药物的耐药菌逐渐增多，多重耐药现 象闩趋严重，已成为兽医和人医临床抗感染治疗的重要难题。根据目前研究水平，细菌(尤其是革兰氏阴性杆菌)对B-内酰胺类药物的最主要耐药机 制是产生B-内酰胺酶。近年来，随着B-内酰胺类药物的大量使用，B-内酰胺酶种类也在不 断增加、新B-内酰胺酶亚型也在不断涌现。由B-lactamases引起的细菌耐药受到了最为广 泛的重视，成为该类药物耐药机理的研究的重点、难点和关注焦点。根据氨基酸序列的同源性，可将e-内酰胺酶分为不同的基因亚型。世界范围内，不同 地区动物源性细菌产e -内酰胺酶有其地域特征。西班牙动物源性B-内酰胺酶多为TEM-1 、 SHV-1 (Zarazagaefa/， 2002);德国(Guerraete/， 2003)、美国(Bradfordefa/， 1999)和英 国(Ransallefa/， 2004)情况相似，TEM-1是最常见的动物源性B-内酰胺酶；葡萄牙动物源 性大肠杆菌中检测出TEM-1和SHV (Antunesete/， 2004; Ferreiraete/， 2002)。 CTX-M型e-内酰胺酶在世界范围内迅速传播，在日本、葡萄牙、西班牙、法国等国均有报道(Morenoete/， 2003; Costaete/' 2004; Bonnerefa/， 2004; Matsumotoefa/， 1988; Teshagerete/， 2000)。香港从猪、牛及鸽子分离了产CTX-M-23、 CTX-M-13、 CTX-M-14 或CTX-M-24大肠杆菌。四川大学动物疾病防控生物工程研究中心对我国19个省97个规 模化猪场分离的602株细菌分子流行病学调查发现，我国主要流行TEM、 SHV和CTX-M 型。本专利在以.匕分子流行病学调查的基础上，建立了 TEM、 SHV禾PI CTX-M型6-内酰胺 酶耐药基因三重PCR检测技术和方法。目前，细菌耐药性检测技术方法主要有常规药敏试验、抗性蛋白检测技术和耐药性分 子检测技术等。常规药敏试验山于方便、简捷、易判定等优点，尤其是药敏纸片琼脂扩散 法，常用于临床指导用药。但药敏试验是在体外用药物试探性地检验细菌的表型耐药特性， 不能检测细菌潜在的耐药性及耐药基因的来源和传播趋势。抗性蛋白检测法由于操作繁琐， 仪器要求高，不够稳定等原因， 一般主要用于对细菌的耐药机理方面的研究。我国畜禽耐药性检测控制与畜产品安全生产中，在药物耐药基因的研究开展得少，尚 无配套的检测试剂盒。耐药基因检测技术主要有PCR(多重PCR)及PCR-限制性片段长度 多态性(PCR-RFLP)技术、PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术以及DNA序列测定等， 其中又以多重PCR技术最有研究前景和应用价值。因为抗菌药物的广泛使用以及耐药基因 的多样性和复杂性，单一临床病原菌经常含有多种耐药基因，为了提高检测的准确性和特 异性，需要对多种耐药基因同时进行检测。多重PCR技术的发展正满足了这种需求，其具 有敏感、特异、快速等优点，可以对极微量的目的基因进行检测。自从Chamberlain (1988) 首次应用多重PCR扩增多个人类肌营养不良蛋白基因以来，多重PCR己发展成为一种通 用技术，广泛应用于病原体鉴别、性别筛选、连锁分析、法医研究、模板定量和遗传疾病 诊断。在病原体鉴别方面具有突出的优点，多重PCR技术可指示许多病原体中的某一个， 或区分同一属中的种或株。近年来，多重PCR技术越来越广泛的应用于细菌耐药性的检测 上。本专利技术的目的是提供一种快速检测动物源细菌对B-内酰胺类药物耐药基因的三重PCR 检测技术方法
本专利技术的目的是通过以下技术方案达到的一种动物源细菌对e -内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术，含有PCR模板制备 试剂和细菌耐药基因三重PCR扩增试剂，其特征在于所述PCR模板制备试剂是由洗涤液、样品处理液组成，所述细菌耐药基因三重PCR扩增试剂包括10倍PCR缓冲液，其 组分为50mM KCI、pH8.3的10mM Tris.HCI和0.01%明胶，浓度均为2.5 mmol/L的dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP，浓度为25mM/L MgCI2，浓度均为25mmol/L三种耐药基因特异 性上下游引物，即CTX-M基因、SHV基因和TEM基因，浓度为5U/ULTaq DNA聚合酶和超纯水。所述动物源细菌B-内酰胺类药物耐药基因二 重PCR扩增试剂各组分的终浓度如 下1倍PCR缓冲液，dGTP、 dCTP、 dATP和dTTP的终浓度各为0.25mmol/L， MgCI2 的终浓度为2.5mM /L， B-内酰胺类药物耐药基因CTX-M、 SHV和TEM的终浓度分别为 0.8mmol/L、 0.5 mmol/L、 0.25 mmol/L， Taq DNA聚合酶终浓度为0.8U/100UL。一种优选技术方案，其特征在于所述样品前处理方法只需离心收集菌体后，经相应 处理液处理即可备用。一种优选技术方案，其特征在于所述PCR模板制备试剂洗涤液的成份为5%的甘油。一种优选技术方案，其特征在于所述PCR模板制备试剂样品处理液的成份为60%的甘油。一种优选技术方案，其特征在于所述的动物源细菌B-内酰胺类药物耐药基因的三重 PCR扩增是将浓度配比适当的三种B-内酰胺类耐药基因上下游引物混在一起扩增。一种优选技术方案，其特征在于所述三种耐药基因即的特异性上下游引物序本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种动物源细菌对β－内酰胺类药物耐药基因三重ＰＣＲ检测技术，含有ＰＣＲ模板制备试剂和细菌耐药基因三重ＰＣＲ扩增试剂，其特征在于：所述ＰＣＲ模板制备试剂是由洗涤液、样品处理液组成，所述细菌耐药基因三重ＰＣＲ扩增试剂包括１０倍ＰＣＲ缓冲液组分为５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８．３的１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ和０．０１％明胶，浓度均为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ和ｄＴＴＰ，浓度为２５ｍＭ／Ｌ ＭｇＣｌ↓［２］，三大类耐药基因即ＣＴＸ－Ｍ基因、ＳＨＶ基因和ＴＥＭ基因的特异性上下游引物浓度均为２５ｍｍｏｌ／Ｌ，浓度为５Ｕ／ＵＬＴａｑ ＤＮＡ聚合酶和超纯水。所述动物源细菌β－内酰胺类药物耐药基因三重ＰＣＲ扩增试剂各组分的终浓度如下：１倍ＰＣＲ缓冲液，ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ和ｄＴＴＰ的终浓度均为０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭｇＣｌ↓［２］的终浓度为２．５ｍＭ／Ｌ，β－内酰胺类药物耐药基因ＣＴＸ－Ｍ、ＳＨＶ、ＴＥＭ的终浓度分别为０．８ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶终浓度为０．８Ｕ／１００ＵＬ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王红宁，田国宝，叶满玉，曾瑜虹，张安云，张毅，夏青青，杨鑫，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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