本发明专利技术公开了一种肺炎克雷伯菌对β－内酰胺酶耐药基因检测方法，属于基因检测方法技术领域，包括以下步骤：１．选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定菌种后采样备用；２．采用微量稀释法测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断；３．采用ＰＣＲ法检测耐药基因，检查β－内酰胺酶耐药基因并选取ＤＮＡ阳性株测序分析。本发明专利技术通过系统全面的对肺炎克雷伯菌的耐药机制进行了研究，发现导致肺炎克雷伯菌耐β内酰胺类药物的耐药基因，对指导临床合理使用抗菌药物具有重要价值，可减少医院院内感染率，降低死亡率，节约社会医疗资源，具有良好的社会和经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因检测方法，尤其是涉及一种肺炎克雷伯菌对 0 -内酰胺酶耐药基因检测方法。
技术介绍
抗菌药物发展的历史，是一部人类与细菌做斗争的历史。人类不 断研制开发新药，细菌则通过改变自已的结构来与抗菌药物相对抗。 抗菌药物的滥用致使耐药菌比例越来越大，耐药程度越来越高，新药 研制的速度已远远不及细菌耐药性产生的速度。抗菌药物滥用是世界 范围内存在的问题，我国尤为严重。据统计，我国住院病人中使用抗菌药物的比例占住院病人的60%-70%，在美国仅为20%。抗菌药物的滥 用直接导致了耐药菌逐年增多，院内感染发生率不断上升。如果不加 强规范、合理用药， 一旦出现耐药菌感染性疾病爆发流行，将会出现 无药可治的尷炝局面。因此，研究细菌耐药机制及其规律就显得十分 紧迫和必要。肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界、健康人的皮肤、肠道和呼吸道。 正常情况下，肺炎克雷伯菌并不感染人体的任何组织。老年病人免疫 力低下，长期大量使用抗菌药物或创伤性医疗操作(如气管切开、尿 道插管和肾透析等)等情况下易引起内源性感染。肺炎克雷伯菌所致 感染中以呼吸道感染、泌尿道感染、菌血症等最为常见。肺炎克雷伯 菌在临床标本的分离率为8. 0%，其耐药率为6.1%-85. 7%。近年来，从临床分离到的肺炎克雷伯菌可耐受多类抗菌药物包括青霉素类、头 孢菌素类、氨基糖苷类、氟喹诺衝类、氯霉素、磺胺类药物等，出现 了多重耐药菌株。为此，针对肺炎克雷伯菌分子耐药机制与感染关系 进行深入研究，对了解本地区肺炎克雷伯菌的耐药基因流行状况、指 导临床合理使用抗菌药物、研发新药的导向等具有重要意义。 专利
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种肺炎克雷伯菌对0 -内酰 胺酶耐药基因检测方法，旨在应用现代分子生物学技术和现代信息技 术进行细菌耐药机制和耐药的相关基因研究，揭示肺炎克雷伯菌对0 内酰胺类抗菌药物产生耐药原因，达到快速诊断细菌的耐药性的目的， 明确本地区肺炎克雷伯菌耐药基因流行状况，为指导临床研究合理使 用抗菌药物提供依据。本专利技术为实现上述目的采取的技术方案如下， 一种肺炎克雷伯菌 对0-内酰胺酶耐药基因检测方法，包括以下步骤-1、 选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定 菌种后采样备用。2、 采用微^#释^*测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断。3、 采用PCR法检测耐药基因，检查P-内酰胺酶耐药基因并选取 DM阳性株测序分析。①、模板制备挑纯培养菌落置入0. 5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶说明书第3/9页液200 u 1) , 56't水浴2小时，改95flC水浴10分钟，加入Chelex-100 幼iil，离心G5000rpm) 30秒。上清液即为基因检测的模板液，-208C 冰箱保存备用。②、基因的检测采用聚合酶链反应(PCR)法，各种靶基因PCK扩增体系均为每反 应体系P,、 P2引物各0， 5 ii M， dNTPs200各mM， KC1 lOmM， (MU 2S04 8mM， MgCl2 2mM， Tris—HC1 (pH9. 0) l薩，NP 0. 5%， BSA 0. 02% (wt/vo1)， Taq D则pol 1U。总反应体积20li 1 (其中模板液5ul)。 PCR扩增产 物〉500bp热循环参数均为93。C预变性2niin，然后93。C60s—55。C60s —72°C60s，循环35周期，最后一个72""C延长至5min。 PCR扩增产物 <500bp热循环参数均为93。C预变性2迈in，然后93'C30s—55。C30s —72"60s，循环35周期，最后一个72'C延长至5min。产物经1%琼脂 糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。优选地，选择以下P-内酰胺酶耐药基因TM、 SHV、 LM、 OKP、 CTX普1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、0XA-1群、0XA-2群、0XA-10群、PER、 GES、 VEB、 DHA、 ACT-1进行耐药性分析，相应的引物序列为Pl: AGGMGAGTATGATTCMCAP2:CTCGTCGTTTGGTATGGCPl :TGCGCMGCTGCTGACCAGCP2:TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAPl:ATGCGTT(A/T)T(A/G)TTCGCCTGTGP2:GGCGCTCAGATGCTGCGCPl:A(A/G)GCGCTTCCCGGCGACGTGP2:TTAGCG(T/C)TGCCAGTGCTCGAPl: ATGGTTAAMMTCACTGCGCP2:TCCCGACGGCTTTCCGCCTTPl:ATGATGACTCAGAGCATTCGP2:TCCCGACGGCTTTCCGCCTT<formula>formula see original document page 7</formula>本专利技术的有益效果如下本专利技术选用目前较常见的医院感染^~~ 肺炎克雷伯菌为研究对象，运用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术 和基因序列比对等现代分子生物学和信息技术，系统全面的对肺炎克 雷伯菌的耐药机制进行了研究，发现导致肺炎克雷伯菌耐P内酰胺类 药物的耐药基因，对指导临床合理使用抗菌药物具有重要价值，可减 少医院院内感染率，降低死亡率，节约社会医疗资源。成果具有良好 的社会和经济效益，推广应用前景广泛。以下结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步说明。 附图说明图1为本专利技术WaTEM基因PCR电泳图；图2为本专利技术W^CTX-M-l群基因PCR电泳图；图3为本专利技术力7aDHA基因PCR电泳图；图4为本专利技术WaCTX-M-15型基因测序图；图5为本专利技术WaSHV型基因测序图。具体实施方式1材料与方法1.1菌株来源及鉴定80株均为分离自2006年1月 2007年10月间患者临床标本，分 别为痰液53份，尿液8份，胆汁4份，脓液5份，弓疏液4份，血 液3份，咽拭子3份。全部菌株均使用ATB细菌鉴定{^鉴定菌种后采样备用o1.2抗菌药物敏感性试验药敏试验按美国CLSI 2006年版要求。质控菌株大肠埃希菌 ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603铜绿假单胞菌ATCC27853、购自 卫生部临床检验中心。1. 3药敏试验抗菌药物敏感试验微量肉汤稀释法。1.4 P内酰胺酶基因检測 1.4.1模板制备挑纯培养菌落置入0. 5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶 液200iil)，56t水浴2小时，改95t水浴10分钟，加入Cheiex-lOO 40ul，离心(15000rpm) 30秒。上清液即为基因检测的模板液，-20°C 冰箱保存备用。1. 4. 2基因的检測采用聚合酶链反应(PCR)法，其中引物序列见表1。各种靶基因PCR 扩增体系均为每反应体系P，、 P2引物各0.5iiM，dNTPs200各mM， KC1 10mM，(鹏)25048爐，MgCL2mM， Tris—HC1 (pH9.0) 10mM， NFVO. 5%， BSA 0.02% (wt/vol)， Taq DM pol 1U。总反应体积20u 1 (其中模板 液5 ii 1)。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肺炎克雷伯菌对β－内酰胺酶耐药基因检测方法，包括以下步骤： （１）、选择住院病人肺炎克雷伯菌菌株，全部菌株经细菌鉴定仪鉴定菌种后采样备用， （２）、采用微量稀释法测定抗菌药物的敏感性，进行抗生素敏感性判断， （３）、采 用ＰＣＲ法检测β－内酰胺酶耐药基因，并选取ＤＮＡ阳性株进行测序分析，所述β－内酰胺酶耐药基因及相应引物序列为： 基因名称 引物序列 ｂｌａＴＥＭ Ｐ１：ＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＴＴＣＡＡＣＡ Ｐ２：ＣＴＣＧＴＣＧＴＴ ＴＧＧＴＡＴＧＧＣ ｂｌａＳＨＶ Ｐ１：ＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＣ Ｐ２：ＴＴＡＧＣＧ（Ｔ／Ｃ）ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡ ｂｌａＬＥＮ Ｐ１：ＡＴＧＣＧＴＴ（Ａ／Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｇ）ＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧ Ｐ２：ＧＧＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣ ｂｌａＯＫＰ Ｐ１：Ａ（Ａ／Ｇ）ＧＣＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧ Ｐ２：ＴＴＡＧＣＧ（Ｔ／Ｃ）ＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡ ｂｌａＣＴＸ－Ｍ－１群 Ｐ１：ＡＴＧＧＴＴＡ ＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣＧＣ Ｐ２：ＴＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＴ ｂｌａＣＴＸ－Ｍ－２群 Ｐ１：ＡＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣＧ Ｐ２：ＴＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＴ ｂｌａＣＴＸ－Ｍ －９群 Ｐ１：ＣＧＧＣＣＴＧＴＡＴＴＴＣＧＣＴＧＴＴＧ Ｐ２：ＴＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＴ ｂｌａＯＸＡ－１群 Ｐ１：ＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＧＣＡＡＧ Ｐ２：ＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＡＴ Ｇ ｂｌａＯＸＡ－２群 Ｐ１：ＣＡＧＧＣＧＣ（Ｔ／Ｃ）ＧＴＴＣＧ（Ｔ／Ｃ）ＧＡＴＧＡＧＴＴ Ｐ２：ＧＣＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＴＡＴＣＣＡＧＴＡＡＴＣＧＣＣ ｂｌａＯＸＡ－１０群 Ｐ１：ＧＴＣＴＴＴＣ（Ａ／Ｇ）ＡＧＴＡＣＧＧＣ ＡＴＴＡ Ｐ２：ＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＡ ｂｌａＰＥＲ Ｐ１：ＡＧＴＣＡＧＣＧＧＣＴＴＡＧＡＴＡ Ｐ２：ＣＧＴＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＴＣ ｂｌａＧＥＳ Ｐ１：ＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＧ ＣＡＣ Ｐ２：ＣＴＡＴＴＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧ ｂｌａＶＥＢ Ｐ１：ＧＣＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡＣＣＡＧＡ Ｐ２：ＧＣＣＴＡ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钟建平，金法祥，李水法，王华均，孙小军，黄明清，
申请(专利权)人：钟建平，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]
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