多糖－蛋白轭合物疫苗制造技术

本发明专利技术公开了以高产率合成和制备多糖－蛋白轭合物疫苗的方法。该方法涉及一种反应物上的酰肼基团与其他反应物上的醛基或氰酸盐酯基的反应。所述反应以较高的轭合效率快速进行，因此可以采用简化的纯化方法从未轭合的蛋白和多糖以及其他小分子副产物中分离出所述轭合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多糖-蛋白轭合物疫苗专利
本专利技术提供了以较高产量合成与制备多糖-蛋白轭合物疫苗的方法。该方法涉及在一种反应物上的酰肼基与另一种反应物上的醛基或氰酸盐酯基反应。所述反应以较高的轭合效率快速进行。可使用简化的纯化方法从未轭合的蛋白和多糖以及其他小分子副产物中分离所述轭合产物。专利技术背景细菌多糖(PSs)是在大龄儿童和成人中诱导短期免疫的非T细胞依赖性抗原，但幼小婴儿却常常缺乏。PSs并不能与主要组织相容性复合物结合，所述主要组织相容性复合物是抗原提呈以及刺激T-辅助淋巴细胞所必需的。PSs可以在无需T-辅助细胞淋巴细胞的帮助下刺激B淋巴细胞产生抗体。作为所述B淋巴细胞非T细胞依赖性刺激的结果，在这些抗原的免疫之后依然缺少记忆诱导。通过多糖与蛋白分子的共价结合，非T细胞依赖性多糖抗原可转变为T细胞依赖性抗原。结合于所述轭合物疫苗多糖部分的B细胞可由辅助性T细胞来活化，该辅助性T细胞对该轭合载体蛋白部分的多肽具有特异性。对该载体蛋白产生应答的T辅助细胞能增强针对该多糖的抗体产生。多糖轭合疫苗是由蛋白与多糖的共价连接形成的多糖-蛋白杂合体。因为大多数天然细菌多糖在先经受某些化学修饰(“活化”)之前不能与蛋白化学相连，所以通常需要在结合前对所述多糖进行化学修饰。对所述蛋白的结合产生了多种T细胞抗原决定簇。这些T细胞抗原决定簇会与CD4辅助性T细胞相互作用，极大地促进对所述结合多糖的抗体应答。甚至在婴儿体内，对轭合物的所述T辅助细胞依赖性应答可产生血清IgG抗体和免疫记忆。而且，与天然多糖相比，所述-->多糖轭合物的免疫原性对所述轭合多糖的大小的依赖程度有所降低。因此，采用多糖或寡糖制备的轭合物具有类似的免疫原性。可采用多种轭合反应将多糖与蛋白共价连接。三种较为常用的方法有：1)还原性氨基化，其中一种反应成分的醛基或酮基与另一种反应成分的氨基或酰肼基反应，所形成的C＝N双键随后被还原剂还原成C-N单键；2)氰基化轭合，其中可通过溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)向该羟基引入一个氰基，在加入蛋白成分后，其与氨基或酰肼基形成共价键；3)碳二亚胺反应，其中碳二亚胺能活化所述轭合反应中一种成份的羧基，所活化的羧基再与另一成分的氨基或酰肼基反应。这些反应经常被用来在所述轭合反应之前对所述轭合物的成份进行活化。b型嗜血流感杆菌(Hib)轭合物疫苗是用于临床的第一种多糖-蛋白轭合物疫苗。Robbins及其同事在1980年运用生物工程技术将糖化学地连接到蛋白载体上，这是50年前就发展出来的概念。参见Avery等人，J.Exp.Med.1929；50：533-550；Schneerson等人，J.Exp.Med1980；152：361-376。在美国目前有四种不同的Hib轭合物疫苗获得了许可，每种各不相同，且各自具有其物理，化学和免疫学特征，如表1所总结。在这些疫苗所使用的轭合化学和质量控制的详细论述已经出版。参见Ellis等人在《b型等嗜血杆菌轭合物疫苗的发展与临床应用》(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugate vaccines)一书中由Kniskem等人所著的《轭合物：设计，化学与分析》″Conjugation：design，chemistry，and analysis″章节，纽约，Marcel Dekker出版社，1994年，37-69页。                           表1 疫苗*  糖大小  载体蛋白  间隔物(连接物) PRP-D (Connaught)  多糖  白喉类毒素  6-碳间隔物  (ADH) HbOC (Wyeth-Lederle)  寡糖  白喉蛋白  (CRM)  无(酰胺)--> PRP-OMPC (Merck)  小分子多糖  脑膜炎球菌蛋白  硫醚  (两属的) PRP-T (Aventis Pasteur)  多糖  破伤风类毒素  6-碳间隔物  (ADH)*所述四种Hib轭合物疫苗通常以其缩写以及括号中对应的生产厂商来进行描述。最先商业化的Hib轭合物，多聚核糖基核糖醇磷酸白喉类毒素轭合物(PRP-D)通过6-碳间隔物、己二酸二酰肼(ADH)连接于白喉类毒素的部分大小减少的Hib多糖，使用的是Schneerson等人的方法，J.Exp.Med.1980；152：361-376。在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在的条件下，使用ADH以该方法进行反应得到了白喉类毒素的ADH衍生物。然后通过使用CNBr在所述羟基上产生氰基来活化所述His多糖。将所活化的多糖与所述ADH-类毒素(氰基化轭合)轭合，但该方法产生的连接不稳定，而且所述轭合物还具有溶解性的问题。随后对Robbins轭合化学进行了改进，使得所述ADH间隔物首先被加在所述多糖上，然后在EDC(碳二亚胺反应)存在的条件下，将该多糖轭合于纯化的蛋白。参见Chu等人，Infect.Immun.1983；40：245-256；Schneerson等人，Infect.Immun.1986，52：519-528。这一改进提高了轭合效率和产物的溶解性。多聚核糖基核糖醇磷酸破伤风蛋白轭合物(PRP-T)疫苗就是利用这一改进的化学方法共价地将Hib多糖连接于破伤风类毒素(参见表1)。多聚核糖基核糖醇磷酸交联反应突变体白喉类毒素轭合物(PRP-CRM)疫苗，也称为嗜血流感杆菌b型寡糖轭合物(HbOC)，并不含有His多糖。相反，它利用的是在核糖醇部分中通过乙二醇官能性的高碘酸氧化衍生得到的约20个重复单位的寡糖。然后在氰基硼氢钠(还原氨基化)存在的条件下，将所述氧化的寡糖直接连接于CRM197，其是从白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)C7(β197)的培养物中分离到的一种白喉毒素的无毒性突变体。参见Anderson等人J.Immunol.-->1989；142：2464-8；以及Anderson，Infect.Immun.1983，39：233-238。在这种轭合方法中，认为寡糖与蛋白的比率对最佳的抗体应答至关重要。参见Ellis等人在《b型等嗜血杆菌轭合物疫苗的开发与临床应用》(Development and clinical uses of Haemophilus b coniugate vaccines)一书中由Kniskem等人所著的《轭合物：设计，化学与分析》″Coniugation：design，chemistry，and analysis″章节，纽约，Marcel Dekker出版社，1994年，37-69页；以及Anderson等人，J.Immunol.1989；142：2464-8。与其他Hib轭合物疫苗相比，Hib多糖-脑膜炎萘瑟菌(Neisseriameningitidis)外膜蛋白复合体轭合物疫苗(PRP-OMPC)具有多种独特的性质。所述蛋白载体并不是白喉，破伤风和百日咳(DTP)疫苗的成分，但却由脂多糖缺失的脑膜炎球菌外膜囊泡以及其上通过硫醚连接的大小缩小的Hib多糖构成。参见Marburg等人J.Amer.Chem.So本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备轭合物疫苗的方法，该方法包括：将多糖与氧化剂反应，由此得到醛活化的多糖溶液；　通过缓冲液更换将所述醛活化的多糖溶液的ｐＨ调至约７．０到约８．０；在ｐＨ约为６至约７，存在１－［３－（二甲基氨基）丙基］－３－乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与肼或己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的蛋白溶液；将所述酰肼活化的蛋白溶液的ｐＨ升高至约７．０到约１１；通过缓冲液更换将所述酰肼活化的蛋白溶液的ｐＨ调至约１０．０到约１１．０；在ｐＨ约６至约８的条件下，将所述醛活化的多糖与酰肼活化的蛋白反应，由此得到含有一或多个Ｃ＝Ｎ双键的轭合物；及将所述轭合物的全部Ｃ＝Ｎ双键基本还原成Ｃ－Ｎ单键，由此得到能刺激免疫反应的轭合物疫苗。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-8-6 60/493,3891.制备轭合物疫苗的方法，该方法包括：将多糖与氧化剂反应，由此得到醛活化的多糖溶液；通过缓冲液更换将所述醛活化的多糖溶液的pH调至约7.0到约8.0；在pH约为6至约7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与肼或己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的蛋白溶液；将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH升高至约7.0到约11；通过缓冲液更换将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH调至约10.0到约11.0；在pH约6至约8的条件下，将所述醛活化的多糖与酰肼活化的蛋白反应，由此得到含有一或多个C＝N双键的轭合物；及将所述轭合物的全部C＝N双键基本还原成C-N单键，由此得到能刺激免疫反应的轭合物疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其中所述氧化剂包括NaIO4。3.如权利要求1所述的方法，其中用HEPES缓冲液对所述醛活化的多糖溶液进行缓冲液更换。4.如权利要求1所述的方法，其中用Na2CO3缓冲液对所述酰肼活化的蛋白溶液进行缓冲液更换。5.如权利要求1所述的方法，其中以约1∶2至约2∶1的比例将所述醛活化的多糖与所述酰肼活化的蛋白反应。6.如权利要求1所述的方法，其中所述还原包括用NaBH4进行还原。-->7.如权利要求1所述的方法，其中所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。8.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM197以及脑膜炎球菌蛋白。9.制备轭合物疫苗的方法，该方法包括：将多糖与1-氰-4-二甲基铵吡啶四氟硼酸反应，由此得到氰酸盐活化的多糖溶液；在pH约为6至约7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与肼或己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的蛋白溶液；将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH升高至约7.0到约11；通过缓冲液更换将所述酰肼活化的蛋白溶液的pH调至约10.0到约11.0；在pH约6至约8的条件下，将所述氰酸盐活化的多糖与酰肼活化的蛋白反应，得到能刺激免疫应答的轭合物疫苗。10.如权利要求9所述的方法，其中所述氰酸盐活化的多糖与酰肼活化的蛋白的反应步骤是在没有封闭剂的条件下进行的。11.如权利要求9所述的方法，其中所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。12.如权利要求9所述的方法，其中所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM197以及脑膜炎球菌蛋白。-->13.制备轭合物疫苗的方法，该方法包括：在pH约为6至约7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)反应，由此得到APDO修饰的蛋白溶液；通过缓冲液更换将所述APDO修饰的蛋白溶液的pH调至约10.0到约11.0；将所述APDO修饰的蛋白与氧化剂反应，由此得到醛活化的蛋白溶液；通过缓冲液更换将所述醛活化的蛋白溶液的pH从约10.0调至约11.0；在pH约6至约8的条件下，将所述酰肼活化的多糖与醛活化的蛋白反应，由此得到含有一或多个C＝N双键的轭合物；及将所述轭合物的全部C＝N双键基本还原成C-N单键...

【专利技术属性】
技术研发人员：车恒罗伯特李，卡尔E弗拉施，
申请(专利权)人：美国政府健康及人类服务部，
类型：发明
国别省市：US[美国]