多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗制造技术

以单剂量混合时，脑膜炎球菌血清群Ｃ、Ｗ１３５和Ｙ的偶联荚膜多糖对人体是安全和具有免疫原性。当加入血清群Ａ的偶联荚膜多糖时，保持了这种作用。这些偶联抗原无需冻干，可在单一水性剂量中稳定地混合。通过使用少量成分明确的多肽抗原，可实现对血清群Ｂ感染的广泛保护力。对五种血清型的任一种而言，这些多肽抗原可与糖抗原混合而不丧失其保护效力。即使加入Ｈｉｂ偶联物，仍然有效。通过加入血清群Ｂ菌株的蛋白抗原，可提高血清群Ｗ１３５偶联物的效力。将Ｈｉｂ偶联物加入到脑膜炎球菌偶联物中可提高对脑膜炎球菌血清群Ｗ１３５的整体活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗这里引用的所有文献全部被纳入本文作为参考。
本专利技术涉及抗细菌性脑膜炎的免疫接种领域，尤其涉及针对多种病原体所引起的细菌性脑膜炎的混合免疫接种。专利技术背景脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)是一种寄居在咽喉部可引起脑膜炎(并且，有时引起败血病而不是脑膜炎)的不能运动的人病原体革兰氏阴性菌。它可引起地方病和流行病。在引入抗b型流感嗜血杆菌(Hib)的偶联疫苗后，脑膜炎奈瑟球菌已成为导致美国细菌性脑膜炎的主要原因。引起细菌性脑膜炎的第三类病原体是肺炎链球菌，但现在已可获得有效的疫苗(PrevNarTM[1])。类似于Hib疫苗，肺炎链球菌疫苗依据的是偶联的荚膜多糖抗原。基于微生物的荚膜多糖，已经鉴定到几种脑膜炎奈瑟球菌的血清群，包括(A，B，C，H，I，K，L，29E，W135，X，Y和Z)。血清群A是撒哈拉沙漠以南非洲最常见的流行疾病原。血清群B和C与绝大部分发生在美国和大多数发达国家的病例有关。美国和发达国家中的其它一些病例是由血清群W135和Y引起的。虽然荚膜多糖是最有效的保护性免疫原，每个血清群需要不同的糖抗原，而且该方法不适于免疫抵御血清群B。因此，近年来采用血清群C的偶联糖疫苗获得成功(MenjugateTM[2]，MeningitecTM和NeisVac-CTM)但对血清群A、B、W135或Y所致疾病却无作用；相反，它们选择性地使这些血清群成为脑膜炎球菌疾病的主要原因。一种可注射的血清群A、C、Y和W135荚膜多糖的四价疫苗已经知道了很多年[3，4]，并批准可用于人类。此疫苗中的多糖不是偶联的，而是以1∶1∶1∶1的重量比存在[5]，各含有50μg纯化多糖。虽然在青少年和成人中有效，但其诱导的免疫应答差、保护时间短，不能用于婴儿[例如，参考6]。而且，该疫苗的缺点是用时需要从冻干形式重建。-->对于血清群B，所提供的一种疫苗效果捉摸不定。试验了其外膜囊泡疫苗[例如，参考7]，但通常保护力只限于用于制备该疫苗的菌种。因此，仍然需要能保护儿童对脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的疫苗，还需要给药前无需重建的疫苗。而且，仍然需要对血清群B能提供广泛保护力的疫苗。专利技术概述本专利技术满足了所有这些需要，依据是八项独立的发现。第一，专利技术者发现，当以单剂量混合时，脑膜炎球菌血清群C、W135和Y的偶联荚膜多糖在人体中安全且具有免疫原性。第二，发现当加入血清群A的偶联荚膜多糖时保持了这种作用。第三，发现这些偶联抗原可以单一水性剂量稳定地混合而无需冻干。第四，发现通过使用少量特定多肽抗原可实现对血清群B感染的广泛保护力。第五，发现这些多肽抗原可与糖抗原联用，而不会丧失对五种血清群任一种的保护效力。第六，发现即使加入Hib偶联物，仍然保持效力。第七，发现加入血清群B菌株的蛋白质抗原可提高血清群W135偶联物的效力。最后，发现将Hib偶联物加入到脑膜炎球菌偶联物中可提高对脑膜炎球菌血清群W135的整体活性。因此，本专利技术提供了一种水性免疫原性组合物，给予受试者后，该组合物能够诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群B、C、W135和Y的杀菌性免疫应答反应，所述组合物包含：(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；和(iv)一种或多种血清群B的多肽抗原。该水性组合物也可诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群A的杀菌性免疫应答反应，因而还包含：(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原。本专利技术还提供一种水性免疫原性组合物，给予受试者后，该组合物可诱导(a)对至少脑膜炎奈瑟球菌血清群W135的杀菌性免疫应答反应和(b)对b型流感嗜血杆菌疾病的保护性免疫应答反应，所述组合物包含：(i)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(ii)偶联的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原。该组合物可还包含血清群C、Y及任选A的偶联荚膜多糖抗原。其还可包含脑膜炎奈瑟球菌血清群B的多肽抗原。优选的糖抗原是寡糖抗原。-->血清群C、W135和Y制备脑膜炎球菌荚膜多糖的技术已经知道了许多年，一般涉及以下步骤：多糖沉淀(例如，使用阳离子去污剂)，乙醇分馏，冷苯酚提取(以除去蛋白质)和超速离心(以除去LPS)[例如，参见8]。一种更优选的方法[9]涉及多糖沉淀后，用低级醇增溶沉淀的多糖。沉淀可采用阳离子去污剂如四丁基铵和十六烷基三甲基铵盐(例如，溴盐)，或溴化己二甲铵和十四烷基三甲基铵盐来实现。尤其优选溴化十六烷基三甲基铵(“CTAB”)[10]。沉淀物质的增溶可采用低级醇如甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二醇等来实现，但特别适合增溶CTAB-多糖复合物的是乙醇。可将乙醇加入到沉淀的多糖中，使最终的乙醇浓度(以乙醇和水的总含量计)为50％-95％。再次溶解后，可进一步处理多糖以除去污染物。这在即使是微量污染物也不能接受的情况下尤其重要(例如，对于人疫苗生产)。这通常将包括一次或多次过滤步骤如深度过滤，可采用活性碳过滤，分子大小过滤和/或超滤。一旦过滤除去污染物，可沉淀多糖作进一步处理和/或加工。这可通过阳离子交换方便地实现(例如，通过加入钙或钠盐)。纯化后，将荚膜多糖与载体蛋白偶联，如下所述。纯化和偶联脑膜炎球菌多糖的其它可选方法见参考文献11和12中所述。另一种替代的纯化方法是从头合成或部分合成，例如参考文献13所述的Hib合成和参考文献14所述的MenA合成方法来获得本专利技术荚膜多糖。可对多糖进行化学修饰，例如O-乙酰化或脱-O-乙酰化。任何脱-O-乙酰化或超-乙酰化可发生在多糖的特定位置上。例如，大多数血清群C菌株的O-乙酰基位于唾液酸残基的C-7和/或C-8上，但约15％的临床分离菌株缺乏这些O-乙酰基团[15，16]。乙酰化似乎不会影响其保护效力(例如，不同于MenjugateTM产品，NeisVac-CTM产品使用了脱-O-乙酰化多糖，但这两种疫苗都有效)。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。血清群Y糖类似于血清群W135糖，除了该二糖重复单元包含葡萄糖而不是半乳糖外。类似于血清群C糖，MenW135和MenY多糖具有不同的O-乙酰化，但位于唾液酸7和9位[上17]。优选在偶联前进行这种化学修饰，但也可在偶联期间进行。优选分别纯化不同血清群的糖，然后在偶联之前或之后混合。-->血清群A本专利技术组合物可包含偶联的血清群A荚膜多糖抗原。可用与血清群C、W135和Y(如上所述)相同的方法纯化和偶联该糖，虽然其结构不同：血清群C、W135和Y的荚膜是围绕的唾液酸(N-乙酰基-神经氨酸，NeuAc)，血清群A的荚膜是N-乙酰基-甘露糖胺(唾液酸的天然前体)。血清群A糖特别易水解，其在水性介质中不稳定性意味着(a)血清群A液体疫苗的免疫原性会随时间下降，(b)由于糖水解产物释放入疫苗，其质量控制更加困难。天然MenA荚膜多糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸盐的均聚物，C3和C4位上有部分O-乙酰化。主要糖苷键是1-6磷酸二酯键，包括D-甘露糖胺的C1半缩醛基和C6醇基。平均链长为93个单体。它具有以下通式：本专利技术者制备了修饰的糖抗原，它保留天然血清群A多糖的免疫原活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水性免疫原性组合物，给予对象后，该组合物能诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５和Ｙ的杀菌性免疫应答反应，其中，所述组合物包含：（ｉ）偶联的血清群Ｃ荚膜多糖抗原；（ｉｉ）偶联的血清群Ｗ１３５荚膜多糖抗原；（ｉｉｉ）偶联的血清群Ｙ荚膜多糖抗原；和（ｉｖ）一种或多种血清群Ｂ多肽抗原。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2003-10-2 0323102.4;GB 2004-5-28 0412052.31.一种水性免疫原性组合物，给予对象后，该组合物能诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群B、C、W135和Y的杀菌性免疫应答反应，其中，所述组合物包含：(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；和(iv)一种或多种血清群B多肽抗原。2.如权利要求1所述的组合物，还包含：(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原。3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，修饰所述血清群A荚膜多糖，以使至少20％的单糖单元在其3和4位的任一位都没有-OH。4.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物可在37℃储存28天，28天后，偶联的MenA糖初始总量只有不到20％将发生解离。5.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述偶联的糖是寡糖。6.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述糖与选自以下的载体蛋白偶联：白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D和CRM197。7.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含1-10种明确的血清群B多肽抗原，并且，所述组合物可诱导对两种或三种脑膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒性谱系A4、ET-5和谱系3的杀菌性免疫应答反应。8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含以下五种抗原中的一种或多种：(i)寡聚体形式的“NadA”蛋白；(ii)“741”蛋白；(iii)“936”蛋白；(iv)“953”蛋白；和(v)“287”蛋白。9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：M肯托尼，
申请(专利权)人：启龙有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]