【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种peg化白介素2(il-2)突变体及其用途。具体地，本专利技术涉及，与亲本il-2相比，具有对treg细胞改善的偏好性且半衰期延长的peg化il-2突变体。本专利技术还提供包含该il-2突变体的组合物，以及编码该il-2突变体的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞。本专利技术进一步提供该il-2突变体及包含其的药物组合物的治疗用途。
技术介绍
1、调节性t细胞(treg)是在20世纪70年代发现的一类cd4+cd25+t细胞，是一种负向免疫调节细胞，主要功能是多方面调节免疫反应和维持免疫稳态。treg细胞是免疫系统内稳态的核心，在维持对自身抗原的耐受性、调节对外来抗原的免疫应答中起到了主要作用。多种自身免疫性疾病，包括风湿性关节炎、i型糖尿病、肾炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮等，均发现存在treg细胞数量或功能的缺陷。因此，开发恢复treg数量或功能的方法，用于治疗多种自身免疫性疾病，已经成为近年来研发的热点。
2、白介素-2(il-2，interleukin-2)，是一种在多种不同免疫细胞类型上表达的多功能细胞因子，其主要由活化的t细胞，尤其是辅助t细胞合成，发挥包括调节机体免疫应答，增强机体免疫监测等生物学功能。在真核细胞中，人il-2(uniprot:p60568)作为153个氨基酸的前体多肽合成，在去除n端20个氨基酸后，产生成熟的分泌性il-2(含有133个氨基酸)。
3、在大多数情况下，il-2通过il-2受体(il-2r)来发挥其作用。il-2r由α(cd25)、β(cd12
4、il-2通过结合不同的il-2受体，在免疫应答中具有双重功能，即其不仅介导效应细胞的增殖和活性，还涉及维持外周免疫耐受。具体而言，作为免疫系统刺激剂，il-2通过与β亚基和γ亚基结合激活t细胞的增殖和分化，诱导细胞毒性t淋巴细胞(ctl)生成，并刺激天然杀伤(nk)细胞的生产、增殖和活化，从而具有抗肿瘤活性；另一方面，已知treg细胞和效应t细胞(teff)之间的失衡是各种自身免疫性疾病的内在原因，而treg细胞上的il-2rα亚基极大增强了il-2和il-2受体β、γ亚基的结合能力，因此，il-2在治疗自身免疫性疾病中有积极的作用。
5、为了改善il-2在自身免疫性疾病中的功效，现有技术中已有的工程化il-2的思路包括：1)采用peg、fc等延长天然il-2半衰期的方法(例如cn201980034052)，然而由于天然il2存在双向调节机制，因此peg化的天然il2无法完全消除对于teff细胞和nk细胞的扩增效果，因此影响了其治疗效果；2)制备il2突变体以改变il-2对受体偏好性的方法，由于il-2本身不太稳定，其突变体通常将更不稳定，因此常规使用的随机突变以找到具有合适特性的分子的方法不适用于il-2蛋白。即便获得了il-2突变体(例如cn100366742c公开的突变体)，由于il-2半衰期较短，因此其成药性不高；以及3)制备il2突变体并与fc或peg融合以提高其半衰期的方法，例如cn201880081506公开了将il2突变体与fc融合的方案，cn201580053284公开了包含d109c取代的il-2突变体与peg融合的方案，这些方案在一定程度上解决了问题，然而cn201880081506公开的具有多个位点突变组合的il-2突变体由于与天然蛋白序列存在较大差异，因此存在免疫原性及半衰期风险，而cn201580053284公开的包含n88r+d109c的peg化il2突变体与未修饰il2(n88r)突变体相比，仅延长了半衰期，偏好性未有显著提升，且该分子对于nk细胞仍具有明显的激活效应。
6、因此，本领域仍然存在开发对treg细胞具有更优良的偏好性，且具有延长的半衰期的新il-2突变体分子的需求，特别是展现出有利生产、纯化、具有改善的药效学性质的il-2突变体分子的需求。
7、本专利技术通过提供相对于亲本il-2具有改善的il-2受体选择性/偏向性、延长的半衰期和/或改善的成药性质的peg定点缀合的新的il-2突变体分子，在一定程度上满足了这些需求。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、本申请在对亲本il-2不同位点进行突变改造，进而进行定点聚乙二醇化修饰的基础上，获得了偏好性强，treg激活程度高，体内药效好的聚乙二醇定点偶联的白介素-2突变体(简称为peg化il-2突变体或il-2突变体，在具体的il-2突变体分子中，有时描述为“peg-il-2”分子，其后通常后缀il-2分子中的具体氨基酸突变)。
2、因此，本申请第一方面提供了一种新的peg化il-2突变体，其具有如下一个或多个优势：
3、(i)增强的与受体il-2rαβγ结合的偏好性；
4、(ii)降低或消除与il-2rβγ的结合；
5、(iii)体外有效激活treg细胞stat5磷酸化，且对teff细胞及nk细胞stat5磷酸化无激活作用；
6、(iv)体内激活更高程度的treg细胞，且对teff细胞及nk细胞无激活作用；
7、(v)延长的半衰期，因而降低了给药频率；
8、(vi)通过优化peg的修饰位点，改善了il-2突变体的安全性；
9、(vii)具有极少数量的对il-2蛋白的突变，因此减少了机体对该突变蛋白的免疫原性风险；
10、(viii)由于il-2的副作用主要是因激活nk细胞引起，因此本申请的il-2突变体因对il-2rβγ具有降低或消除的亲和力，因此基本上不引起nk细胞的激活，从而极大地降低或减少了il-2突变体的毒副作用。
11、在一些实施方案中，本申请提供了一种il-2突变体，该突变体包含采用天然氨基酸或非天然氨基酸对亲本il-2特定氨基酸残基进行修饰，优选所述修饰是氨基酸取代。
12、在一些实施方案中，本申请提供的il-2突变体所包含的氨基酸取代用于与peg分子位点特异性缀合。因此，本申请公开的缀合有peg的il-2突变体也称为peg化突变体。
13、在一些实施方案中，本申请提供的peg化il-2突变体包含在il-2氨基酸序列中第33、75、77、84、88、91、109位氨基酸的一个或者多个氨基酸突变，氨基酸位置标号根据seqid no:1所示的亲本序列进行编号，其中peg分子与第33、75、77、84、91、109位氨基酸之一缀合。
14、在一个具体实施方案中，peg分子包含与蛋白质进行缀本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种IL-2突变体，其与SEQ ID NO:1所示的亲本序列具有至少95％的序列同一性，且相对于SEQ ID NO:1所示的序列在选自如下一个或者多个位置处包含取代：N33、S75、N77、D84、N88、V91和D109。
2.权利要求1所述的IL-2突变体，其中采用天然氨基酸或非天然氨基酸对所述位置进行取代。
3.权利要求1-2中任一项所述的IL-2突变体，其中所述非天然氨基酸选自：赖氨酸类似物、半胱氨酸类似物或组氨酸类似物、苯丙氨酸类似物、包含芳族侧链的非天然氨基酸、包含叠氮基的非天然氨基酸、包含炔烃基团的非天然氨基酸或包含醛或酮基团的非天然氨基酸。
4.权利要求1-3中任一项所述的IL-2突变体，其中所述非天然氨基酸选自苯丙氨酸类似物或赖氨酸类似物，优选地，所述苯丙氨酸类似物是对乙酰基苯丙氨酸，所述赖氨酸类似物是N-Ε-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的IL-2突变体，其中所述取代选自N33C、S75C、N77C、D84C、N88R、N88C、V91C、D109C中的一个或者多个；或选自N33p
6.权利要求1-5中任一项所述的IL-2突变体，其中所述取代包含N88的取代和选自N33、S75、N77、D84、V91和D109中任一个取代的组合。
7.权利要求1-6中任一项所述的IL-2突变体，其中所述取代包含N88R取代和选自N33、S75、N77、D84、V91和D109中任一处取代的组合，其中对除N88R之外的另一个氨基酸取代进行水溶性聚合物修饰，例如水溶性聚合物是PEG分子。
8.权利要求7所述的IL-2突变体，其中所述PEG分子可以为直链分子或支链分子。
9.权利要求7或8所述的IL-2突变体，其中所述PEG分子具有5-100K Da的平均分子量，优选20K～100K，更优选40k～80k的平均分子量。
10.权利要求7-9中任一项所述的IL-2突变体，其中所述PEG分子包含与蛋白质进行缀合的化学反应性基团，例如马来酰亚胺基团、羟胺基团、叠氮基团。
11.权利要求1-10中任一项所述的IL-2突变体，其中所述IL-2突变体包含N88R取代，且PEG分子与第77位取代的残基缀合。
12.权利要求11所述的IL-2突变体，其中所述第77位取代的残基选自半胱氨酸、对乙酰基苯丙氨酸或N-Ε-炔丙氧基羰基-L-赖氨酸。
13.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的IL-2突变体。
14.一种核酸分子，其编码权利要求1-12中任一项所述的IL-2突变体。
15.一种载体，其包含权利要求14所述的核酸分子。
16.一种宿主细胞，其包含权利要求14所述的核酸分子或者包含权利要求15所述的载体。
17.一种制备如权利要求1-12中任一项所述IL-2突变体的方法，包括：
18.一种治疗受试者疾病或降低器官移植排斥的方法，包括将有效量的权利要求1-12中任一项所述的IL-2突变体或权利要求13所述的药物组合物施用于受试者。
19.权利要求1-12中任一项所述的IL-2突变体或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗疾病或降低器官移植排斥的药物中的用途。
20.权利要求18所述的方法或权利要求19所述的用途，其中所述疾病是炎症性疾病(例如自身免疫性疾病、强直性脊柱炎、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、丙型肝炎血管炎、硬化性胆管炎、炎性肌病、复发性多软骨炎、白塞氏病)、冠状动脉疾病、巨噬细胞活化综合征、急性肺损伤、高血压病、Takayasu病、杜氏肌肉营养不良、短暂性缺血性卒中、缺血性心脏病、Wiskott-Aldrich综合征、骨髓移植、移植类适应症(例如角膜移植、胰岛移植、皮肤移植)，优选地，所述自身免疫性疾病是风湿性关节炎、自身免疫脑炎、I型糖尿病、肾炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、皮肤红斑狼疮、狼疮性肾炎、干燥综合征、银屑病、斑块状银屑病、斑秃、皮肌炎、硬皮病、重症肌无力、脱髓鞘疾病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、自身免疫性肾小球肾炎、肺肾出血性综合症、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫性肝炎、自身免疫性血管炎、特应性皮炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症。
21.一种改善IL-2受体激活偏好性，同时延长IL-2突变体的半衰期的方法，包括：
22.权利要求21所述的方法，其中所述天然氨基酸或...
【技术特征摘要】
1.一种il-2突变体，其与seq id no:1所示的亲本序列具有至少95％的序列同一性，且相对于seq id no:1所示的序列在选自如下一个或者多个位置处包含取代：n33、s75、n77、d84、n88、v91和d109。
2.权利要求1所述的il-2突变体，其中采用天然氨基酸或非天然氨基酸对所述位置进行取代。
3.权利要求1-2中任一项所述的il-2突变体，其中所述非天然氨基酸选自：赖氨酸类似物、半胱氨酸类似物或组氨酸类似物、苯丙氨酸类似物、包含芳族侧链的非天然氨基酸、包含叠氮基的非天然氨基酸、包含炔烃基团的非天然氨基酸或包含醛或酮基团的非天然氨基酸。
4.权利要求1-3中任一项所述的il-2突变体，其中所述非天然氨基酸选自苯丙氨酸类似物或赖氨酸类似物，优选地，所述苯丙氨酸类似物是对乙酰基苯丙氨酸，所述赖氨酸类似物是n-ε-炔丙氧基羰基-l-赖氨酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的il-2突变体，其中所述取代选自n33c、s75c、n77c、d84c、n88r、n88c、v91c、d109c中的一个或者多个；或选自n33pacf、n77pacf或n88r中的一个或者多个；或选自n33prk、n77prk或n88r中的一个或者多个。
6.权利要求1-5中任一项所述的il-2突变体，其中所述取代包含n88的取代和选自n33、s75、n77、d84、v91和d109中任一个取代的组合。
7.权利要求1-6中任一项所述的il-2突变体，其中所述取代包含n88r取代和选自n33、s75、n77、d84、v91和d109中任一处取代的组合，其中对除n88r之外的另一个氨基酸取代进行水溶性聚合物修饰，例如水溶性聚合物是peg分子。
8.权利要求7所述的il-2突变体，其中所述peg分子可以为直链分子或支链分子。
9.权利要求7或8所述的il-2突变体，其中所述peg分子具有5-100k da的平均分子量，优选20k～100k，更优选40k～80k的平均分子量。
10.权利要求7-9中任一项所述的il-2突变体，其中所述peg分子包含与蛋白质进行缀合的化学反应性基团，例如马来酰亚胺基团、羟胺基团、叠氮基团。
11.权利要求1-10中任一项所述的il-2突变体，其中所述il-2突变体包含n88r取代，且peg分子与第77位取代的残基缀合。
12.权利要求11所述的il-2突变体，其中所述第77位取代的残基选自半胱氨酸、对乙酰基苯丙氨酸或n-ε-炔丙氧基羰基-l-赖氨酸。
13.一种药物组合物，其包含权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：仲恺，吴伟，齐心，熊新辉，张弢，王青，王凯启，叶懿，
申请(专利权)人：南京诺艾新生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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