【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及p450bm3突变体及其在黄体酮合成皮甾酮中的应用，属于生物工程领域。
技术介绍
1、p450bm3是一种来自土壤细菌bacillus megaterium的细胞色素p450酶，已知具有高的催化活性和底物特异性。由于其能够执行多种不同的氧化反应，p450bm3在合成化学和工业生产中受到广泛关注。此外，p450bm3与其它p450酶相比，具有较高的溶解度和表达量，使其在科学研究和工业应用中具有优势。然而，野生型的p450bm3对许多化合物的催化效率不理想。为了提高其催化效率或改变底物特异性，研究人员对p450bm3进行了多次的定向进化和突变设计。
2、黄体酮(progesterone)是一种重要的内分泌激素，主要在女性体内产生，对于维持妊娠和调节月经等生理过程具有关键作用。其化学结构属于固醇酮，它也是许多其他生物活性固醇类激素的前体，因此，在医药合成中具有很高的价值。皮甾酮(cortexolone)是黄体酮的一个衍生物，也属于固醇类化合物。它在生物体中不像黄体酮那样作为主要激素存在，但在医药和生物化学领域具有研究价值。在化学合成工业中，皮甾酮可以作为某些固醇类药物的中间体或前体。
3、传统的黄体酮转化为皮甾酮的方法涉及多步骤的化学合成。这些方法可能需要使用有害试剂、产生大量副产品，且转化效率不高。因此，利用生物催化，特别是通过对p450bm3进行定向进化来实现黄体酮的高效转化为皮甾酮，不仅有望提高产率，还为生产过程带来更绿色、更经济的解决方案。
技术实现思路
1、基于上述现状，本专利技术利用酶工程的手段，理性改造了p450bm3，使其可以较高的羟化黄体酮的c-17和c-21位，进而合成皮甾酮，为扩大其工业化应用创造条件。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种黄体酮转化皮甾酮能力提高的p450bm3酶，是在出发序列的基础上，具有f87、p25、p329、e435、s72、l437、a330、a74中一个或多个氨基酸突变。
3、在一种实施方式中，所述p450bm3酶来源于bacillus megaterium atcc 14581，所述出发序列如seq id no.2所示。
4、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示序列第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，突变体命名为f87a，可以催化1mm黄体酮合成0.14mm羟基黄体酮。。
5、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示序列第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，第25位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，突变体命名为f87a/p25a，突变体可以催化1mm黄体酮合成0.40mm羟基黄体酮。
6、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示序列第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，第25位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第329位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，突变体命名为f87a/p25a/p329a，可以催化1mm黄体酮合成0.75mm羟基黄体酮。。
7、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示序列第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，第25位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第329位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第435位谷氨酸(glu)突变为天冬氨酸(asp)，突变体命名为f87a/p25a/p329a/e435d，可以催化1mm黄体酮合成0.97mm羟基黄体酮。
8、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示序列第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，第25位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第329位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第435位谷氨酸(glu)突变为天冬氨酸(asp)，第72位丝氨酸(ser)突变为谷氨酰胺(gln)，突变体命名为f87a/s72q/p25a/p329a/e435d，可以催化1mm黄体酮合成0.78mm羟基黄体酮。
9、在一种实施方式中，所述突变体是第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，第25位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第329位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第435位谷氨酸(glu)突变为天冬氨酸(asp)，第72位丝氨酸(ser)突变为谷氨酰胺(gln)，第437位亮氨酸(leu)突变为甘氨酸(gly)，突变体命名为p25a/s72q/f87a/p329a/e435d/l437g，可以催化1mm黄体酮合成0.87mm的17αoh-黄体酮。
10、在一种实施方式中，所述突变体是第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，第25位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第329位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第435位谷氨酸(glu)突变为天冬氨酸(asp)，第72位丝氨酸(ser)突变为谷氨酰胺(gln)，第437位亮氨酸(leu)突变为甘氨酸(gly)，第330位丙氨酸(ala)突变为酪氨酸(tyr)，突变体命名为p25a/s72q/f87a/p329a/a330y/e435d/l437g，可以催化1mm黄体酮合成0.1mm的皮甾酮。
11、在一种实施方式中，所述突变体是第87位苯丙氨酸(phe)突变为丙氨酸(ala)，第25位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第329位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，第435位谷氨酸(glu)突变为天冬氨酸(asp)，第72位丝氨酸(ser)突变为谷氨酰胺(gln)，第437位亮氨酸(leu)突变为甘氨酸(gly)，第330位丙氨酸(ala)突变为酪氨酸(tyr)，第74位丙氨酸(ala)突变为脯氨酸(pro)，突变体命名为p25a/s72q/a74p/f87a/p329a/a330y/e435d/l437g，其氨基酸序列如seq id no.3所示，可以催化1mm黄体酮合成0.28mm的皮甾酮。
12、本专利技术还提供编码所述突变体的基因。
13、在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
14、本专利技术还提供携带所述基因的质粒。
15、在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pet-28(a)。
16、本专利技术还提供表达所述p450bm3酶的重组微生物细胞。
17、在一种实施方式中，所述重组微生物细胞为大肠杆菌。
18、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于e.coli bl21(de3)系列。
19、在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是在e.coli bl21(de3)中用pet-28(a)表达所述p450bm3突变体。
20、本专利技术还提供了一种产p450bm3酶的方法，是将所述重组大肠杆菌在tb培养基中培养至od600＝0.6-0.8，加入终浓度为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.P450BM3突变体，其特征在于，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的P450BM3为亲本，在亲本的F87、P25、P329、E435、S72、L437、A330、A74的一个或多个位点突变。
2.根据权利要求1所述的P450BM3突变体，其特征在于，所述突变体是在亲本的基础上，进行突变，所述突变包括(a)～(l)所示任一：
3.编码权利要求1或2所述P450BM3突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的微生物细胞。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET28a-1为表达载体，表达SEQ ID NO.3所示的P450BM3突变体。
7.一种产P450BM3酶的方法，其特征在于，将权利要求6所述的重组大肠杆菌在TB培养基中培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.1-0.3mM的IPTG，于16～25℃诱导。
8.一种提高羟化黄体酮转化率的方法，其特征
9.权利要求1或2所述P450BM3突变体，或权利要求5所述的微生物细胞，或权利要求6所述的重组大肠杆菌在羟化黄体酮合成皮甾酮方面的应用。
10.权利要求1或2所述的P450BM3突变体在食品、医药、化工、化妆品或饲料领域生产产品方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.p450bm3突变体，其特征在于，所述突变体以氨基酸序列如seq id no.2所示的p450bm3为亲本，在亲本的f87、p25、p329、e435、s72、l437、a330、a74的一个或多个位点突变。
2.根据权利要求1所述的p450bm3突变体，其特征在于，所述突变体是在亲本的基础上，进行突变，所述突变包括(a)～(l)所示任一：
3.编码权利要求1或2所述p450bm3突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的微生物细胞。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以e.coli bl21(de3)为宿主，以pet28a-1为表达载体，表达seq id no.3所...
【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，刘喜荣，陈启航，晁子凯，曾伟主，徐沙，陈坚，孟浩，
申请(专利权)人：湖南新合新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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