【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酿酒酵母7-脱氢胆固醇还原酶突变体的制备及应用，属于酶工程。
技术介绍
1、胆固醇是一种脂质分子，在人体中扮演着至关重要的角色。它是细胞膜的重要组成部分，参与了细胞信号传导、激素合成(包括性激素和肾上腺皮质激素)以及维生素d的生成。此外，胆固醇是胆汁酸的前体，对于脂溶性维生素的吸收也至关重要。然而，过多的胆固醇摄入与也会引起心血管疾病和或其他健康问题相关。胆固醇也是医药和食品工业的关键原料之一，它被广泛用于制药业中生产激素、维生素、荷尔蒙药物和其他重要化合物。此外，胆固醇还是食品工业中一些产品的原材料，如食品添加剂和营养补充剂。胆固醇的生物合成途径包括多个酶催化的反应步骤，其中7-脱氢胆固醇还原酶(dhcr7)酶参与了将7-脱氢胆固醇转化为胆固醇的关键步骤。dhcr7酶通过还原7-脱氢胆固醇的双键，将其转化为胆固醇，这是胆固醇生物合成途径的决定性步骤之一。dhcr7酶在十一年前就被认为具有病毒疗法的潜力。事实上，有许多高处方药物是dhcr7的脱靶抑制剂。
2、传统胆固醇生产方法通常依赖于复杂的化学合成过程，需要高昂的成本和大量的化学废物处理。此外，传统方法的效率有限，合成速率相对较低。因此，寻求一种高效、可控和经济的胆固醇合成方法具有重要的实际意义。通过基因工程技术，可以改变酶的催化性质，从而提高其活性或特异性。对dhcr7基因的改变可以导致dhcr7酶的突变体，这些突变体可以使7-脱氢胆固醇具有更高的催化活性，使其成为高效的胆固醇合成催化剂。通过改进dhcr7酶的催化效率，可以提高胆固醇生产的速度和效
技术实现思路
1、基于上述现状，为实现在酿酒酵母体内胆固醇生物合成量的提高，本专利技术利用基因工程和酶工程的手段，对酿酒酵母7-脱氢胆固醇还原酶进行了突变，提高胆固醇的产量，为扩大其工业化应用创造条件。
2、本专利技术提供了7-脱氢胆固醇还原酶突变体，以seq id no.1所示的7-脱氢胆固醇还原酶(dhcr7)为出发序列，截短了第2到21位氨基酸。
3、在一种实施方式中，截短后的7-脱氢胆固醇还原酶突变体具有seq id no.2所示的氨基酸序列。
4、在一种实施方式中，所述7-脱氢胆固醇还原酶突变体以seq id no.2所示序列为出发序列，将第53位、第68位、第281位、第291位、第427位、第430位、第434位、的一个或多个位点进行突变。
5、在一种实施方式中，所述突变体是将第53位异亮氨酸(ile)突变为苯丙氨酸(phe)，突变体命名为i53f。
6、在一种实施方式中，所述突变体是将第53位异亮氨酸(ile)突变为酪氨酸(tyr)，突变体命名为i53y。
7、在一种实施方式中，所述突变体是将第53位异亮氨酸(ile)突变为色氨酸(trp)，突变体命名为i53w。
8、在一种实施方式中，所述突变体是第68位亮氨酸(leu)突变为缬氨酸(val)，突变体命名为l68v。
9、在一种实施方式中，所述突变体是将第281位色氨酸(trp)突变为酪氨酸(tyr)，突变体命名为w281y。
10、在一种实施方式中，所述将第291位酪氨酸(tyr)突变为色氨酸(trp)，突变体命名为y291w。
11、在一种实施方式中，所述突变体是将第427位亮氨酸(leu)突变为缬氨酸(val)，突变体命名为l427v。
12、在一种实施方式中，所述突变体是将第430位苯丙氨酸(phe)突变为酪氨酸(tyr)，突变体命名为f430y。
13、在一种实施方式中，所述突变体是将第434位苯丙氨酸(phe)突变为酪氨酸(tyr)，突变体命名为f434y。
14、在一种实施方式中，所述突变体是将第68位亮氨酸(leu)突变为缬氨酸(val)，并将第427位亮氨酸(leu)突变为丙氨酸(ala)，突变体命名为l68v/l427a。
15、在一种实施方式中，所述突变体是第430位苯丙氨酸(phe)突变为酪氨酸(tyr)，并将434位苯丙氨酸(phe)突变为酪氨酸(tyr)，突变体命名为f430y/f434yf。
16、在一种实施方式中，所述突变体是将第281位色氨酸(trp)突变为酪氨酸(tyr)，并将第291位酪氨酸(tyr)突变为色氨酸(trp)，突变体命名为w281y/y291w。
17、在一种实施方式中，所述突变体是将第430位苯丙氨酸(phe)突变为酪氨酸(tyr)，并将434位苯丙氨酸(phe)突变为酪氨酸(tyr)，第68位亮氨酸(leu)突变为缬氨酸(val)，并将第427位亮氨酸(leu)突变为丙氨酸(ala)，突变体命名为f430y/f434yf/l68v/l427a。
18、本专利技术还提供了编码所述7-脱氢胆固醇还原酶突变体的基因。
19、在一种实施方式中，所述基因的序列如seq id no.5所示。
20、本专利技术还提供携带所述基因的重组质粒。
21、在一种实施方式中，所述重组质粒以py26为出发质粒。
22、本专利技术还提供表达所述7-脱氢胆固醇还原酶突变体或携带所述基因的微生物细胞。
23、在一种实施方式中，所述微生物细胞为酿酒酵母。
24、在一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母c800，公开于论文《reengineeringof7-dehydrocholesterol biosynthesis in saccharomyces cerevisiae usingcombined pathway and organelle strategies》中。
25、本专利技术还提供了所述酿酒酵母工程菌在生产胆固醇中的应用。
26、在一种实施方式中，将所述酿酒酵母工程菌株在ynb或ypd培养基中，于30℃发酵72h-96h。
27、在一种实施方式中，所述应用是用于制备含有胆固醇的药物和食品。
28、有益效果：
29、本专利技术以酿酒酵母上海生工合成的牛来源的7-脱氢胆固醇还原酶(dhcr7，genbank：nm_201330)为目标，通过截短信号肽，并定点突变改造dhcr7的氨基酸序列，获得了胆固醇产量提升的7-脱氢胆固醇还原酶突变体i53f、i53y、i53w、l68v、l68a、w281y、y291w、l427v、f430y、f434y、l68v/l427a、f430y/f434y、w281y/y291w，通过对表达有dhcr7突变体的菌株进行摇瓶发酵，胆固醇产量达到44mg/l、51mg/l、69mg/l、63mg/l、28mg/l、48mg/l、56mg/l、53mg/l、78mg/l、56mg/l、91mg/l、104mg/l、61mg/l，分别较表达野生型7-脱氢胆固醇还原酶菌株的产量(18mg/l)提高了144％、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.7-脱氢胆固醇还原酶突变体，其特征在于，为(a)或(b)：
2.根据权利要求1所述的7-脱氢胆固醇还原酶突变体，其特征在于，所述突变包括(a)～(f)至少一种突变：
3.将第68位亮氨酸突变为缬氨酸，并将第427位亮氨酸突变为丙氨酸；
4.编码权利要求1～3任一所述7-脱氢胆固醇还原酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。
6.表达权利要求1～3任一所述7-脱氢胆固醇还原酶突变体，或含有权利要求4所述基因的微生物细胞。
7.一种重组酿酒酵母，其特征在于，以酿酒酵母C800为宿主，表达了权利要求1～3任一所述的7-脱氢胆固醇还原酶突变体。
8.一种发酵生产胆固醇的方法，其特征在于，将权利要求7所述的重组酿酒酵母在培养基中培养一段时间。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基包括但不限于YNB培养基；所述培养是在30℃培养至少48h。
10.权利要求1～3任一所述的7-脱氢胆固醇还原酶突变体，或权利要求4所述的基因，或权利要求6所述的微生物细胞
...【技术特征摘要】
1.7-脱氢胆固醇还原酶突变体，其特征在于，为(a)或(b)：
2.根据权利要求1所述的7-脱氢胆固醇还原酶突变体，其特征在于，所述突变包括(a)～(f)至少一种突变：
3.将第68位亮氨酸突变为缬氨酸，并将第427位亮氨酸突变为丙氨酸；
4.编码权利要求1～3任一所述7-脱氢胆固醇还原酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。
6.表达权利要求1～3任一所述7-脱氢胆固醇还原酶突变体，或含有权利要求4所述基因的微生物细胞。
7.一种重组酿酒酵母，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，刘喜荣，晁子凯，陈启航，徐沙，曾伟主，陈坚，孟浩，
申请(专利权)人：湖南新合新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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