【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，更具体地，涉及一种基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法、系统、设备、介质和程序产品。
技术介绍
1、目前的医疗，特别是个性化或精准医疗，越来越依赖于dna分析。临床样品中的dna越来越多地用于寻找疾病的诊断，预后和预测生物标志物。随着测序技术的发展，二代和三代测序在疾病研究、临床诊断和个体化医疗中发挥着重要作用。基因检测已经成为科学研究和医学实践中不可或缺的工具。相比于全基因组测序(whole genome sequencing，wgs)，靶向测序技术旨在对特定基因区域或基因组内特定序列进行快速、准确的测序分析。通过引入特定的引物或探针，靶向测序能够选择性地放大和测序感兴趣的基因区域。这种精准的方法在研究遗传变异、致病基因的发现、肿瘤基因突变分析、病原微生物及其耐药基因检测等方面发挥着重要作用。
2、目前最常用的基因捕获方法包括探针杂交捕获技术和多重pcr扩增技术。其中，探针杂交捕获技术利用核酸碱基互补配对的原理，根据研究需求，设计针对特定基因组区域的带修饰探针，与加上测序接头的核酸文库进行杂交，使探针与目标dna序列特异性结合。探针与目标区域形成的复合物可通过磁珠或其他方法回收，将目标区域从整个dna样本中捕获出来。虽然相对于全基因组测序来说，探针杂交捕获测序通常成本较低，但受制于探针设计和合成等成本，其整个捕获流程成本依然较高。此外，探针杂交捕获技术还有着操作复杂、耗时长等缺点。多重pcr扩增技术是一种在单个反应中同时扩增多个目标序列的pcr技术。它通过在同一反应中同时引入
3、此外，近年来，随着crispr/cas(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(crispr)/crispr-associatedprotein)系统的发展，其应用已经不再局限于基因编辑领域。crispr/cas9系统可通过sgrna靶向目标序列进行切割，并通过切割后连接某种修饰用于分离目标片段。但这种切割的策略通常需要对样本核酸进行末端钝化等前处理，操作繁琐；且对sgrna的位置选择通常有诸多限制，如sgrna(single guiderna)间隔过小会导致目标序列被cas9切割过于碎片化影响核酸回收效率。上述缺点限制了crispr/cas9系统在核酸捕获检测领域更广泛的应用。经过改造后的dcas9，即失活型cas9(dead cas9，dcas9)，虽然失去了核酸酶活性，但保留dna结合能力，为crispr/cas系统应用于核酸捕获领域带来了新的可能性。通常情况下，dcas9多应用于基因表达调控和表观修饰等研究中。通过在dcas9的c端融合各种具有转录调控功能的结构域，可招募转录因子或者修饰目标区域，从而研究目标基因的转录调控。目前，dcas9在转录调控方面已得到了广泛应用，但其在核酸捕获领域的潜在应用仍需进一步探索。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提供一种基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法及其系统；本专利技术方法通过利用缺失核酸酶活性而保留dna结合能力的失活型cas9(dead cas9，dcas9)与sgrna组成复合物对提取后核酸直接进行靶序列的捕获。生物素等标记的dcas9与sgrna形成的复合物可特异性与目标靶序列结合，再利用链霉亲和素等捕获方法实现对靶序列的有效富集。本专利技术解决现有靶向测序操作复杂、耗时长、成本高、无法直接对超长和超短核酸进行捕获等问题。
2、本申请第一方面公开一种基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法，所述方法包括：
3、获取包含有靶序列的dna序列；所述靶序列包括：200-1000bp的序列、大于等于1000bp的序列、小于等于200bp的序列；
4、获取dcas9-sgrna复合物；
5、混合所述dna序列和所述dcas9-sgrna复合物，所述dcas9-sgrna复合物捕获所述dna序列中的靶序列，得到dcas9-sgrna复合物与靶序列相结合的dcas9-sgrna-dna复合物。
6、在一些实施例中，所述靶序列包括：大于等于10kb的序列；
7、可选的，所述靶序列包括：60-120bp的序列；优选包括：以下任一种长度的序列：60bp、80bp、100bp、120bp。
8、在一些实施例中，所述dcas9-sgrna复合物的获取方法包括：
9、获取sgrna；
10、按照指定间隔长度从所述sgrna中确定目标sgrna；
11、获取所述目标sgrna的正向引物和反向引物；
12、基于所述正向引物和反向引物，利用pcr技术合成体外转录用使用的模板dna，得到pcr产物；
13、对pcr产物进行纯化处理，得到纯化后的sgrna；
14、按照体系混合标准组装所述纯化后的sgrna，得到所述dcas9-sgrna复合物；
15、可选的，所述指定间隔长度包括以下任一种或几种：20bp、100bp、200bp；
16、可选的，所述获取sgrna中sgrna通过以下方法得到：确定靶序列；根据pam序列确定所述靶序列上的sgrna；从所述靶序列上的sgrna中筛选出符合要求的sgrna即为所述sgrna；
17、可选的，所述筛选的标准包括以下任一种或几种：gc含量在区间内、均聚物小于等于第一阈值、双核甘酸重复小于等于第二阈值、无发夹结构、无人基因组脱靶；
18、可选的，所述纯化处理包括：利用固相介质纯化所述pcr产物，得到纯化后的sgrna模板dna；利用体外转录试剂盒进行体外转录，去除模板dna，得到体外转录sgrna；利用rna纯化试剂盒纯化所述体外转录sgrna，得到所述纯化后的sgrna；
19、可选的，所述体系混合标准包括以下组分：sgrna、dcas9-biotin、反应缓冲液、无核酸酶水。
20、在一些实施例中，所述dcas9-sgrna复合物包括无核酸酶活性的cas9蛋白与sgrna结合形成的复合物；
21、可选的，所述dcas9蛋白包括常规dcas9蛋白以及经过其他改造过程形成的各种dcas9蛋白。
22、在一些实施例中，所述包含有靶序列的dna序列来自以下任一种或几种样本：人源细胞、鲍曼不动杆菌acinetobacterbaumanniiatcc 19606、肺炎克雷伯菌klebsiellapneumoniaeatcc 43816、大肠杆菌escherichia co本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序方法，其特征在于，所述靶序列包括：大于等于10kb的序列；
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序方法，其特征在于，所述dCas9-sgRNA复合物的获取方法包括：
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序方法，其特征在于，所述dCas9-sgRNA复合物包括无核酸酶活性的Cas9蛋白与sgRNA结合形成的复合物；
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序方法，其特征在于，所述包含有靶序列的DNA序列来自以下任一种或几种样本：人源细胞、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii ATCC 19606、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae ATCC43816、大肠杆菌Escherichia coli ATCC 11775、铜绿假单胞菌Pse
6.根据权利要求1-4任一项所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序方法，其特征在于，所述方法还包括：利用固相介质捕获所述dCas9-sgRNA-DNA复合物，得到捕获后的固相介质；对所述固相介质进行清洗和纯化，得到纯化后的靶标DNA；
7.基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序系统，其特征在于，所述系统包括：
8.一种计算机设备，其特征在于，所述设备包括：存储器和处理器；所述存储器用于存储程序指令；所述处理器用于调用程序指令，当程序指令被执行时，用于执行权利要求1-6任意一项所述的方法的步骤。
9.一种计算机可读存储介质，其特征在于，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现上述的权利要求1-6任意一项所述的方法的步骤。
10.一种权利要求1-6任一项所述的基于CRISPR-dCas9的DNA靶向捕获测序方法在制备DNA检测、诊断及治疗试剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法，其特征在于，所述靶序列包括：大于等于10kb的序列；
3.根据权利要求1所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法，其特征在于，所述dcas9-sgrna复合物的获取方法包括：
4.根据权利要求1所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法，其特征在于，所述dcas9-sgrna复合物包括无核酸酶活性的cas9蛋白与sgrna结合形成的复合物；
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于crispr-dcas9的dna靶向捕获测序方法，其特征在于，所述包含有靶序列的dna序列来自以下任一种或几种样本：人源细胞、鲍曼不动杆菌acinetobacter baumannii atcc 19606、肺炎克雷伯菌klebsiella pneumoniae atcc43816、大肠杆菌escherichia coli atcc 11775、铜绿假单胞菌pseu...
【专利技术属性】
技术研发人员：王姣，张晓丽，邓涛，常玉俊，朱修篁，蔚跃，赵丽倩，孙立超，
申请(专利权)人：北京博奥医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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