【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，具体地，涉及利用高特异性向导rna和crispr-dcas9去除宏基因组中宿主dna的方法。
技术介绍
1、clustered regularly interspaced short palindromic repeats(crispr)-associated protein 9(cas9)系统是细菌对抗噬菌体感染的一种防御机制，其作用原理是在向导rna(guide rna，grna)的介导下，cas9与靶dna结合并对靶dna进行双链切割。cas9与靶dna的结合只有在pam(protospacer adjacent motif)序列存在且紧邻pam的互补链上的17-20个碱基与grna互补时才会发生。针对不需要dna切割的应用，人们将cas9的核酸内切酶活性位点进行了突变得到dcas9(dead cas9)，dcas9仍具有与dna结合的能力。crispr-dcas9系统已被广泛应用于转录调控、基因组成像和dna捕获等研究。
2、宏基因组测序(mngs)是无偏差检测临床样本中病原微生物的技术，该技术面临的一个主要挑战是在待检测的宏基因组样本中存在大量的宿主核酸，这些宿主核酸在测序过程中不仅占了绝大多数的测序数据量导致浪费，还会降低微生物的检测灵敏度，因此，去除宏基因组样本中的宿主dna成为提高宏基因组检测灵敏度、降低测序成本的一项关键技术。目前常用的去宿主方法为差异裂解法，大多数细菌和真菌具有细胞壁结构，比人的细胞膜要更加坚固，因此，利用较温和的裂解缓冲液可以实现对人源细胞裂解的同时保留大
3、与差异裂解法不同，对提取后的宏基因组样本用crispr-dcas9的方法进行人dna的去除，可以有效避免微生物dna的损失，该方法操作简单、特异性高、不具有微生物偏好性且基本不受样本状态的影响。然而，现有的crispr-dcas9去宿主方法使用的sgrna，其与dna结合的序列(crrna)长度都为20nt，由于20nt crrna 5’端两个碱基容错率较高，导致目前方法具有较高的非特异性，容易造成微生物损失；此外，目前方法的sgrna靶向的dna为全基因组上一定间隔的序列或者为alu元件，前者对基因组的覆盖范围广但需要的sgrna条数较多，导致对sgrna的设计、合成、制备和质检较繁琐、成本较高，后者对基因组的覆盖范围有限，会影响对宿主dna的去除效率，即目前方法使用的sgrna不能满足控制成本的同时获得较高的去人源效率。
技术实现思路
1、有鉴于此，为了克服目前本领域存在的上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种利用高特异性向导rna和crispr-dcas9去除宏基因组中宿主dna的方法。为了提高现有crispr-dcas9方法去除宿主dna的特异性，本专利技术设计高特异性、长度为18nt(比20ntcrrna 5’端少两个碱基)的crrna序列；此外，为了兼顾crispr-dcas9去宿主方法的成本与效率，本专利技术针对在人基因组上分布广泛、且分布位点具有互补特性的灵长类特异性alu和l1(l1pa)元件的保守序列设计sgrna。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面提供了一组高特异性和高宿主dna去除效率的sgrna。
4、进一步，所述sgrna包括靶向alu的alu_trusgrna和/或靶向l1的l1_trusgrna；
5、所述alu_trusgrna为alu_trusgrna_1～alu_trusgrna_8；
6、所述l1_trusgrna为l1_trusgrna_1～l1_trusgrna_8；
7、所述alu_trusgrna_1～alu_trusgrna_8的序列如seq id no:17～24所示；
8、所述l1_trusgrna_1～l1_trusgrna_8的序列如seq id no:25～32所示。
9、在本专利技术中，所述sgrna(single guide rna)是指单向导rna，是一种在基因工程中常用的分子工具。sgrna是由crrna(crispr rna)和tracrrna(transactivating crisprrna)通过基因工程手段进行改造而得到的。sgrna可以与目标dna序列互补，形成rna-dna杂交，然后激活cas9(crispr-associated protein 9)酶。
10、在本专利技术的具体实施方案中，制备本专利技术第一方面所述的sgrna所需的引物序列分别如seq id no:34～66所示，制备本专利技术第一方面所述的sgrna所需的模板序列如seqid no:33所示。
11、本专利技术的第二方面提供了一种sgrna-dcas9复合物。
12、进一步，所述sgrna-dcas9复合物包含本专利技术第一方面所述的sgrna；
13、优选地，所述sgrna-dcas9复合物还包含dcas9、10x neb buffer、rnaseinhibitor；
14、更优选地，所述alu_trusgrna、l1_trusgrna、dcas9、10x neb buffer、rnaseinhibitor的使用量分别为(0.1～0.5)μg、(0.1～0.5)μg、(0.1～1)μg、(0.5～1.5)μl、(0.1～1)μl、(5～15)μl；
15、最优选地，所述alu_trusgrna、l1_trusgrna、dcas9、10x neb buffer、rnaseinhibitor的使用量分别为0.25μg、0.25μg、0.5μg、1μl、0.5μl、10μl；
16、最优选地，所述sgrna-dcas9复合物由nfw补加至10μl。
17、在本专利技术中，所述dcas9(dead cas9)是一种cas9蛋白的突变体，通过将ruvc(d10a)和nhn(h840a)两个核酸酶结构域分别进行氨基酸突变，从而得到一个没有核酸酶活性的cas9蛋白，使其失去切割dna的功能，但仍保留结合dna的能力，这样的cas9称之为dcas9。目前crispr-dcas9系统常用于基因组转录调控，用以激活或抑制特定基因的表达，从而达到研究基因功能的目的。
18、在本专利技术的具体实施方案中，为了提高crispr-dcas9系统去除人源dna的特异性，本专利技术针对alu设计了长度为18nt和20nt的crrna，并通过体外转录合成了长度为98nt的trusgrna(truncated single-guide rna)和100nt的sgrna，将两种长度的sgrna分别与dcas9蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组高特异性和高宿主DNA去除效率的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括靶向Alu的Alu_trusgRNA和/或靶向L1的L1_trusgRNA；
2.一种sgRNA-dCas9复合物，其特征在于，所述sgRNA-dCas9复合物包含权利要求1所述的sgRNA；
3.一种高特异性、高效率去除宏基因组中宿主DNA的试剂，其特征在于，所述试剂包含权利要求2所述的sgRNA-dCas9复合物。
4.一种高特异性、高效率去除宏基因组中宿主DNA的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求3所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
6.一种利用高特异性sgRNA和CRISPR-dCas9去除宏基因组中宿主DNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述sgRNA-dCas9复合物中还包括dCas9、10X NEB buffer、RNase inhibitor；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述包被有链霉亲和素的磁珠为M-270链霉亲和素磁珠。
10.权利要求1所述的sgRNA、权利要求2所述的sgRNA-dCas9复合物、权利要求3所述的试剂或权利要求4所述的产品在采用CRISPR-dCas9去除宏基因组中宿主DNA中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一组高特异性和高宿主dna去除效率的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括靶向alu的alu_trusgrna和/或靶向l1的l1_trusgrna；
2.一种sgrna-dcas9复合物，其特征在于，所述sgrna-dcas9复合物包含权利要求1所述的sgrna；
3.一种高特异性、高效率去除宏基因组中宿主dna的试剂，其特征在于，所述试剂包含权利要求2所述的sgrna-dcas9复合物。
4.一种高特异性、高效率去除宏基因组中宿主dna的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求3所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒。
6.一种利用高特异性sgrna和crispr-dcas9去除宏基因组中宿主dn...
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓丽，邓涛，常玉俊，朱修篁，侯婉如，刘建红，曹学敏，孙立超，
申请(专利权)人：北京博奥医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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