【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物分子生物学检测，具体而言，涉及一种适用于病原核酸检测的痰液预处理试剂组合及其使用方法。
技术介绍
1、在空气污染日趋严重的大环境下，呼吸道疾病，如肺结核、重症肺炎、囊性纤维病、流感、慢性阻塞性肺病等，已成为严重威胁人类健康的重大公共卫生问题。引起肺部感染的常见菌有金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、曲霉、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。不同的肺部感染在发病机制、临床表现、严重程度以及预后方面都可能有所不同，但共同点在于难以鉴别诊断，且往往引起较为严重的感染，其预后较差，死亡率较高。传统病原微生物检测方法如显微镜检、分离培养、血清学和免疫学检测等，存在灵敏度/特异度低、费时、易受抗菌药物影响等缺点。近年来，基于二代测序的宏基因组检测技术因其不依赖于预判、无需特异扩增，能够快速客观地检测样本中所有病原微生物的序列信息，已日益成为临床感染性疾病的新型诊断助手。
2、痰液作为常见的呼吸道疾病病原微生物检测样本，被广泛应用于呼吸道感染的病原微生物检测中，但其成分复杂，除病原微生物外，还含有大量粘液、炎症细胞以及坏死的粘膜上皮细胞等，粘稠度大，使得大量的病原微生物包裹在痰液中，难以被释放。在提取核酸前，需经预处理匀质后即液化，才能使样本中的病原微生物核酸得到有效释放。另外，痰液同样包裹了大量的人源细胞，若不经去宿主基因组的处理，mngs测序所得数据中人源序列占比可达99.9％，造成极大的数据浪费和病原微生物检测灵敏度的降低。普通的去宿主试剂，直接用于痰液标本，会受到痰液
3、目前针对痰液病原微生物宏基因组检测的样本液化仍有两大难点，从而限制自动化、通量化的分子检测。一是痰液中有大量粘液，使其中细胞不易分离；二是痰液组成很复杂，成分包含粘液、异物、病原微生物，各种炎症细胞、坏死脱落的粘膜上皮细胞等。故高纯度、高质量的核酸获取有一定的困难。
4、痰液液化常用的方法主要有三种：①naoh碱裂解法，其反应较为剧烈，且无选择性，会导致病原微生物和人源细胞同步被裂解，并被去宿主步骤去除，影响病原微生物核酸的富集效率。②dtt还原法，利用巯基(-sh)断裂痰液中致粘稠的主要成分粘蛋白，对细胞作用温和，能保留细胞完整性，但常无法还原包埋于蛋白质结构内部的、溶液不可及的二硫键，因此多出现消化不完全现象，且耗时较长。③蛋白酶法，同样无选择性，可实现完全液化，但利用酶解反应消化粘蛋白效率低，耗时较长，且对痰液中的细胞及病原微生物损伤较大。除以上三种方法具有降低核酸质量的风险外，在实际操作中，细胞破裂释放的核酸酶以及操作过程中因污染引入的核酸酶会造成痰液样本中的核酸(尤其是rna)极不稳定。
5、因此，亟需一种适用于病原核酸检测的痰液预处理试剂组合及其使用方法，该试剂组合不仅可以液化痰液还可以对液化后的痰液进行去宿主化处理，所处理后的痰液样本可以用于工作站上mngs测序的核酸提取，在尽量保留痰液中病原微生物的完整特性同时，避免直接接触从而降低人员感染和样品交叉污染的机率，实现快速、经济、简便的痰液处理工作。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种适用于病原核酸检测的痰液预处理试剂组合及其使用方法。本专利技术通过合理配制各组份，能够快速溶解以及稳定痰液样本，还能够有效抑制核酸酶的活性并防止病原微生物裂解，从而实现痰液液化的自动化。
2、本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
3、本专利技术的一个方面提供了一种适用于病原核酸检测的痰液预处理试剂组合，所述试剂组合包括痰液液化试剂；所述液化试剂包括以下成分：10-15％核酸酶抑制剂，30-50mm粘液溶解剂，15-20mm螯合剂，20mm naoh以及0.25％表面活性剂。
4、在一个优选的实施方案中，所述核酸酶抑制剂为盐酸胍或异硫氰酸胍。
5、在一个优选的实施方案中，所述粘液溶解剂为n-乙酰基-l-半胱氨酸。
6、在一个优选的实施方案中，所述螯合剂为2,6-吡啶二羧酸。
7、在一个优选的实施方案中，所述表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。
8、在一个优选的实施方案中，所述试剂组合还包括去宿主化试剂，所述去宿主化试剂包括以下成分：8-10％皂素、无菌水、10-15mm氯化镁、6-8u dnase i酶、5-7u蛋白酶k。
9、本专利技术的另一个方面还提供了一种适用于病原核酸检测的痰液预处理试剂组合中的痰液液化试剂的制备方法，该方法包括：将10-15％核酸酶抑制剂，30-50mm粘液溶解剂，15-20mm螯合剂，20mm naoh以及0.25％表面活性剂混合均匀即可。
10、本专利技术的又一个方面还提供了一种痰液液化方法，在于使用前述的痰液液化试剂对痰液进行处理的过程，所述方法包括以下步骤：
11、将痰液样本与液化试剂混匀后进行初次孵育；
12、孵育完加入蛋白酶k混匀后继续再次孵育，当痰液变清亮时，停止反应，离心取上清液，即得液化后的痰液样本。
13、在一个优选的实施方案中，所述初次孵育条件为：温度37℃，时间20min，每5min摇晃一次。
14、在一个优选的实施方案中，所述再次孵育条件为：温度56℃，时间10min，每5min摇晃一次。
15、在一个优选的实施方案中，还包括将所得液化后的痰液样本进行去宿主及微生物核酸提取的步骤，具体为使用去宿主化试剂对液化后的痰液样本进行去宿主化处理，然后进行微生物核酸提取。
16、在一个优选的实施方案中，上述去宿主化具体步骤为：在痰液液化后样本中加入8-10％皂素溶液，震荡混匀10s，室温孵育5min，加入无菌水，室温孵育30s，马上加入10-15mm氯化镁，震荡混匀后，离心分离，弃上清；随后加入pbs重悬沉淀，加入6-8udnase i酶，颠倒混匀多次后，37℃孵育15min；加入5-7u蛋白酶k，56℃孵育30min。
17、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点：本专利技术通过配制合适的痰液液化试剂和酶解法相结合，对痰液进行温和液化，效果佳，时间短，同时也保留了微生物细胞的完整性，使匀质化后的样本可用于后续宏基因组测序。本专利技术所采用的螯合剂为2,6-吡啶二羧酸，相比于传统的螯合剂edta，该螯合剂具有更强的配位能力，更有利于保留痰液中病原微生物的完整特性。
18、上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明如后。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种适用于病原核酸检测的痰液预处理试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括痰液液化试剂；所述液化试剂包括以下成分：10-15％核酸酶抑制剂，30-50mM粘液溶解剂，15-20mM螯合剂，20mM NaOH以及0.25％表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为盐酸胍或异硫氰酸胍。
3.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述粘液溶解剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述螯合剂为2,6-吡啶二羧酸。
5.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。
6.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合还包括去宿主化试剂，所述去宿主化试剂包括以下成分：8-10％皂素、无菌水、10-15mM氯化镁、6-8UDNase I酶、5-7U蛋白酶K。
7.一种痰液液化方法，其特征在于，使用权利要求1-5中任一项所述的试剂组合对痰液进行处理的过程，所述方法包括以下步骤：
8.根据权利要求
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述再次孵育条件为：温度56℃，时间10min，每5min摇晃一次。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括将所得液化后的痰液样本进行去宿主及微生物核酸提取的步骤，具体为使用去宿主化试剂对液化后的痰液样本进行去宿主化处理，然后进行微生物核酸提取。
...【技术特征摘要】
1.一种适用于病原核酸检测的痰液预处理试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括痰液液化试剂；所述液化试剂包括以下成分：10-15％核酸酶抑制剂，30-50mm粘液溶解剂，15-20mm螯合剂，20mm naoh以及0.25％表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为盐酸胍或异硫氰酸胍。
3.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述粘液溶解剂为n-乙酰基-l-半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述螯合剂为2,6-吡啶二羧酸。
5.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。
6.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合还包括去宿主化试...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟坤，邓涛，曹学敏，常玉俊，邢婉丽，
申请(专利权)人：北京博奥医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。