【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测结直肠癌肿瘤细胞相关微生物的方法，具体涉及一种排除肠道粪便微生物污染并检测结直肠癌肿瘤相关微生物的方法，属于生物。
技术介绍
1、结直肠癌(colorectal cancer，crc)是消化道最常见的恶性肿瘤之一。已知，人体内最多的微生物位于胃肠道，这个复杂的生态系统被称为肠道微生物群。随着测序技术和生物信息学的发展，使得人们深入研究肠道微生态的组成、代谢和宏基因组成为可能[1]。尽管很多研究从不同角度揭示了肠道菌群与crc的密切关系，但大多研究都集中在肠道粪便菌群及其代谢物上[2]。鉴于粪便中菌群的庞大复杂性及其与肠黏膜上皮的作用依赖多因素调控，且大多数细菌属于“过路菌”而非“定植菌”，人们逐渐意识到，探究细菌富集并侵入肿瘤组织和细胞的直接作用证据和生物学行为，将成为这一领域有潜力的研究方向。
2、因此，近年来，有一些研究开始关注与肿瘤相关的微生物群。肿瘤微生物群是肿瘤微环境的重要组成部分[3-5]。研究表明肿瘤微生物群是肿瘤组织的重要组分，在塑造肿瘤微环境方面发挥着关键作用[6,7]。瘤内菌多存在于在细胞内，主要存在于癌症细胞和免疫细胞中，每种肿瘤类型都有不同的微生物组成[4]。肿瘤内菌及其预测的功能与肿瘤类型、亚型以及对免疫治疗的反应有关[4]。被细菌感染的癌细胞以单个细胞的形式入侵其周围的环境，并将骨髓细胞招募到细菌区域。肿瘤内微生物主要分布和富集在具有促进癌症进展功能的免疫和上皮细胞中[3]。综上所述，肿瘤相关微生物在诱导肿瘤发生、改变细胞代谢、促进肿瘤转移、避免免疫监视等方面发挥着更
3、然而，区别于乳腺癌等与外界环境没有直接联系的实体肿瘤，crc肿瘤微生物由于肠道褶皱和绒毛结构而受到粪便微生物的严重污染(图1)。处理污染和对肿瘤相关微生物群的检测已经成为限制此类肿瘤微生物群检测的技术困难。
4、[1].bastiaanssen t f s,cowan c s m,claesson m j,et al.making sense ofthe microbiome in psychiatry[j].int j neuropsychopharmacol,2019.22(1):37-52.
5、[2].dougherty mw,jobin c.intestinal bacteria and colorectal cancer:etiology and treatment.gut microbes.2023.15(1):2185028.
6、[3].galeanojl,wu h,lacourse kd,et al.effect of the intratumoralmicrobiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer.nature.2022.611(7937):810-817.
7、[4].nejman d,livyatan i,fuks g,et al.the human tumor microbiome iscomposed of tumor type-specific intracellular bacteria.science.2020.368(6494):973-980.
8、[5].sepich-poore gd,zitvogel l,straussman r,hasty j,wargo ja,knightr.the microbiome and human cancer.science.2021.371(6536):eabc4552.
9、[6].tumors appear rife with bacterial lodgers.cancer discov.2020.10(8):1085-1086.
10、[7].fu a,yao b,dong t,cai s.emerging roles of intratumor microbiotain cancer metastasis.trends cell biol.2023.33(7):583-593.
11、[8].liu z,hong ll,ling zq.potential role of intratumor bacteriaoutside the gastrointestinal tract:more than passengers.cancer med.2023.12(16):16756-16773.
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、结直肠癌肿瘤相关微生物对结直肠癌的发生发展起着至关重要的作用，但区别于乳腺癌等与外界环境没有直接联系的实体肿瘤，结直肠癌因其皱褶和肠道绒毛结构而受到粪便微生物的严重污染，使得本来就低生物量的结直肠癌相关微生物被掩盖，很难检出。如何排除粪便菌群干扰，准确检测结直肠癌细胞相关微生物仍然是个难点。
3、用于解决问题的方案
4、在本专利技术中，专利技术人通过对结直肠癌组织进行不同的处理，并对处理后的样本进行结直肠肿瘤相关微生物的检测，最终从中找到了一种分离结直肠癌肿瘤细胞相关微生物群的新方法。分析和比较了不同方法检测到的微生物群和潜在功能，获得了结直肠癌的肿瘤细胞相关微生物。
5、通过粗剪、酶解消化等步骤破坏肠道皱襞和绒毛结构，并制备收集单细胞悬液，初次排除肠道结构中的粪便微生物污染；再利用细胞筛过滤去除未消化完全的组织块，进一步排除肠道粪便菌的污染，收集单细胞悬液；利用300g离心力反复清洗单细胞悬液，最终只保留牢牢定植在细胞上或细胞内的微生物。最后再送检测序。
6、本专利技术提供了如下技术方案：
7、[1].一种检测结直肠癌细胞相关微生物的方法，其中，所述方法包含：
8、初步排除样本中肠道褶皱和绒毛结构中的粪便微生物污染的步骤，包括将样本进行粗剪和酶解消化；
9、进一步排除肠道粪微生物污染的步骤，包括将酶解消化得到的细胞悬液经细胞筛过滤，收集单细胞悬液；以及，
10、去除污染菌和过路菌的步骤，将所述单细胞悬液进行清洗并离心，获得单细胞。
11、[2].根据[1]所述的方法，其中，所述酶解消化包括将粗剪后的样本在酶催化剂的作用下酶解分离得到细胞悬液。
12、[3].根据[2]所述的方法，其中，所述酶催化剂包括中性蛋白酶和胶原酶。
13、[4].根据[3]所述的方法，其中，所述中性蛋白酶为中性蛋白酶ⅱ，所述胶原酶为胶原酶ⅳ。
14、[5].根据[1]～[4]任一项所述的方法，其中，所述细胞筛的孔径为40μm。
15、[6].根据[1]～[5]任一项所述的方法，其中，使用磷酸盐缓冲溶液对单细胞悬液清洗，并经280～300g离心，收集单细胞。
16、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测结直肠癌细胞相关微生物的方法，其特征在于，所述方法包含：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解消化包括将粗剪后的样本在酶催化剂的作用下酶解分离得到细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶催化剂包括中性蛋白酶和胶原酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶为中性蛋白酶Ⅱ，所述胶原酶为胶原酶Ⅳ。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞筛的孔径为40μm。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，使用磷酸盐缓冲溶液对单细胞悬液清洗，并经280～300g离心，收集单细胞。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述样本包括结直肠组织，所述结直肠组织包括结直肠癌组织和正常组织。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，在将样本粗剪之前，利用生理盐水对样本清洗3遍。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含：检测的步骤，其包括将去除污染菌和过路菌的
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述检测包括通过5R 16SrRNA基因测序技术对检测样品进行检测。
...【技术特征摘要】
1.一种检测结直肠癌细胞相关微生物的方法，其特征在于，所述方法包含：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解消化包括将粗剪后的样本在酶催化剂的作用下酶解分离得到细胞悬液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶催化剂包括中性蛋白酶和胶原酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶为中性蛋白酶ⅱ，所述胶原酶为胶原酶ⅳ。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞筛的孔径为40μm。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，使用磷酸盐缓冲溶液对单细胞悬液清洗，...
【专利技术属性】
技术研发人员：左彦珍，孙大永，杨芳，庞佳昱，鲁艳杰，靳顺康，张鑫宇，许倩，李玉红，
申请(专利权)人：承德医学院，
类型：发明
国别省市：
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