【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体而言，涉及一种利用乳酸产丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
1、l-丙氨酸作为一种重要的氨基酸，在化工、食品和医药等领域有着广泛的应用。
2、目前，l-丙氨酸的生产主要有化学法、酶转化法和发酵法。化学法生产的l-丙氨酸质量较差，而且生产过程易造成环境污染，不适宜大规模生产。酶转化法主要有两种，一种是通过天冬氨酸脱羧生成，另一种是以苹果酸为底物，通过苹果酸酶与l-丙氨酸脱氢酶共同固定的方法生成，但天冬氨酸和苹果酸的价格都较高，很难实现工业化生产。发酵法以葡萄糖为原料，利用基因工程菌发酵生产l-丙氨酸，发酵法对环境较为温和，但也存在糖酸转化率低、发酵液成分复杂、提取困难等问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种利用乳酸产丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法与应用。本专利技术构建了一种双酶共表达的工程菌，实现了l-丙氨酸的高效生产。
2、本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
3、本专利技术的一个方面提供了一种利用乳酸产丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌可以同时表达外源l/d-乳酸脱氢酶和l-丙氨酸脱氢酶，所述方法包括以下步骤：
4、将编码乳酸脱氢酶和l-丙氨酸脱氢酶的基因，依次连接到表达质粒pxb1k上，构建得到双酶共表达重组质粒；
5、将所得双酶共表达质粒转化到大肠杆菌escherichia coli bw251
6、优选地，所述l-乳酸脱氢酶来自于escherichia coli str.k12 mg1655，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nc_000913.3(3779827..3781017)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为np_418062.1的序列。
7、优选地，所述d-乳酸脱氢酶来自于escherichia coli str.k12 mg1655，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nc_000913.3(1441854..1442843)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为np_415898.1的序列。
8、优选地，所述l-乳酸脱氢酶来自于klebsiella pneumoniae strain bh2511，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nz_nfyg01000023.1(122214..123398)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为：wp_087874898.1的序列。
9、优选地，所述l-乳酸脱氢酶来自于lactiplantibacillus paraplantarum strainfl-8，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nz_cp118745.1(477999..478961)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为：wp_131509336.1的序列。
10、优选地，l-丙氨酸脱氢酶来自于geobacillus stearothermophilus straings27scaffold38，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nz_lucr01000070.1(19329..20193)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为：wp_064213455.1的序列。
11、本专利技术的另一个方面还提供了一种生产丙氨酸的方法，包括以下步骤：
12、将重组大肠杆菌转接到lb培养基中进行一次培养，之后转接到自诱导培养基中进行二次培养培养，培养结束后，离心收集细胞；
13、将上述离心收集的细胞进行全细胞催化反应，得到l-丙氨酸。
14、优选地，所述一次培养条件为：接种量为2～5％，温度35～39℃，转速220～250rpm，时间16～18h；所述二次培养条件为：接种量为2～5％，温度28～32℃，转速220～250rpm，时间16～18h；所述离心条件为：温度4～8℃，转速4000～6000rpm，时间10～15min。
15、优选地，所述全细胞催化反应体系组成为：1x m9培养基，细胞浓度10～30od，l-乳酸钠10～50g/l，氯化铵2～25g/l，硫酸镁0.12～0.6g/l，ph5.0～8.0。
16、优选地，所述全细胞催化反应条件为：温度30～40℃，摇床转速220～250rpm，催化反应时间1～24h。
17、本专利技术的又一个方面还提供了一种基因工程菌在医药、食品、化工等领域的应用。
18、本专利技术的再一个方面还提供了一种根据本专利技术的方法构建得到的基因工程菌或生产的丙氨酸在医药、食品、化工等领域的应用。
19、借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点：本专利技术构建了一种新型的双酶共表达大肠杆菌基因工程菌，该菌可用于l-丙氨酸的生产。与单酶表达体系需要同时培养两株重组大肠杆菌相比，本专利技术构建的双酶共表达大肠杆菌基因工程菌，仅需诱导培养一株重组大肠杆菌即可，并且丙氨酸产量更高、操作更为简便、原料损耗和成本更小。本专利技术选用的底物造价便宜且易获取，l-丙氨酸的生产过程简单，具有良好的工业化应用前景。
20、上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例详细说明如后。
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1.一种利用乳酸产丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌可以同时表达外源L/D-乳酸脱氢酶和L-丙氨酸脱氢酶，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述L-乳酸脱氢酶来自于Escherichia coli str.K12 MG1655，其核苷酸序列是NCBI上accession No为NC_000913.3(3779827..3781017)的序列，氨基酸序列是NCBI上accession No为NP_418062.1的序列。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述D-乳酸脱氢酶来自于Escherichia coli str.K12 MG1655，其核苷酸序列是NCBI上accession No为NC_000913.3(1441854..1442843)的序列，氨基酸序列是NCBI上accession No为NP_415898.1的序列。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述L-乳酸脱氢酶来自于Klebsiellapneumoniae strain BH2511，其核
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述L-乳酸脱氢酶来自于Lactiplantibacillus paraplantarum strain FL-8，其核苷酸序列是NCBI上accessionNo为NZ_CP118745.1(477999..478961)的序列，氨基酸序列是NCBI上accession No为：WP_131509336.1的序列。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，L-丙氨酸脱氢酶来自于Geobacillusstearothermophilus strain GS27 scaffold38，其核苷酸序列是NCBI上accession No为NZ_LUCR01000070.1(19329..20193)的序列，氨基酸序列是NCBI上accession No为：WP_064213455.1的序列。
7.一种生产丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述一次培养条件为：接种量为2～5％，温度35～39℃，转速220～250rpm，时间16～18h；所述二次培养条件为：接种量为2～5％，温度28～32℃，转速220～250rpm，时间16～18h；所述离心条件为：温度4～8℃，转速4000～6000rpm，时间10～15min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应体系组成为：1X M9培养基，细胞浓度10～30OD，L-乳酸钠10～50g/L，氯化铵2～25g/L，硫酸镁0.12～0.6g/L，pH5.0～8.0。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应条件为：温度30～40℃，摇床转速220～250rpm，催化反应时间1～24h。
...【技术特征摘要】
1.一种利用乳酸产丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，所述基因工程菌可以同时表达外源l/d-乳酸脱氢酶和l-丙氨酸脱氢酶，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述l-乳酸脱氢酶来自于escherichia coli str.k12 mg1655，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nc_000913.3(3779827..3781017)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为np_418062.1的序列。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述d-乳酸脱氢酶来自于escherichia coli str.k12 mg1655，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nc_000913.3(1441854..1442843)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为np_415898.1的序列。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述l-乳酸脱氢酶来自于klebsiellapneumoniae strain bh2511，其核苷酸序列是ncbi上accession no为nz_nfyg01000023.1(122214..123398)的序列，氨基酸序列是ncbi上accession no为：wp_087874898.1的序列。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述l-乳酸脱氢酶来自于lactiplantibacillus paraplantarum strain fl-8，其核...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨巍，张莎莎，史鲁秋，薛虹宇，李华山，
申请(专利权)人：南京盛德创赢生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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