【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物的生物改造，具体涉及一种重组盐单胞菌及其在生产异戊二烯中的应用。
技术介绍
1、异戊二烯(isoprene)是一种具有挥发性的共轭二烯烃，主要用于生产异戊橡胶和定级橡胶，用量约占异戊二烯产量的95%。此外，还可用于合成异戊烯氯、甲基庚烯酮、芳樟醇、柠檬醛、月桂烯、薰衣草醇等多种具有高附加值的精细化学品。随着乙烯工业的发展和合成橡胶需求量的增加，异戊二烯的生产和应用受到越来越多的关注。
2、工业生产异戊二烯的方法主要有c5馏分分离法、异戊烷烃或异戊烯烃脱氢法、烯醛法和丙酮法，其原料几乎全部来自于石油产品。虽然石油来源的异戊二烯简单易得，但是这些方法受石油价格和供应波动，以及会对环境造成严重污染。因此，开发一种以可再生资源为原料，利用环保、高效的生物技术来生产异戊二烯成为研究热点。异戊二烯生物合成途径有甲羟戊酸（mva）途径和甲基赤藓糖醇磷酸（mep）途径。目前，已在大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和蓝藻中，通过代谢工程改造mva和mep途径构建微生物细胞工程合成异戊二烯。其中，利用工程化大肠杆菌生产异戊二烯的效果最好。然而大肠杆菌作为宿主细胞，其基因表达需要添加昂贵的诱导剂，并且大规模发酵容易染菌，灭菌过程能耗高、工艺操作复杂，生产成本高。而且，有文献显示虽然研究表明来源于粪肠球菌的mva上游途径转化效率最高，但是将其基因整合到大肠杆菌染色体上之后，mva途径的转化效率却受到了下游途径的限制。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是利用下一代工业技术，使
2、本专利技术的第一方面，提供了一种重组盐单胞菌（ halomonas），所述的重组盐单胞菌（ halomonas）：
3、a）表达或过表达idi-isps复合体，所述的idi-isps复合体包括异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶，其中，异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶通过连接肽连接；或者，
4、b）所述的重组盐单胞菌的基因组中包含导入基因，所述的导入基因包括异戊烯基焦磷酸异构酶编码基因和异戊二烯合成酶编码基因，其中，异戊烯基焦磷酸异构酶编码基因和异戊二烯合成酶编码基因通过编码连接肽的序列连接。
5、其中，
6、异戊烯基焦磷酸异构酶具有将异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸相互转化的功能。
7、异戊二烯合成酶具有将二甲基烯丙基焦磷酸催化合成异戊二烯的功能。
8、本专利技术所述的idi-isps复合体具有异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶的功能。
9、优选的，所述的连接肽选自刚性接头、柔性接头或无意义氨基酸。
10、优选的，所述的连接肽可以缩短酶与底物之间的距离。进一步优选缩短异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶的距离。
11、进一步优选的，所述的连接肽包含ridd-riad短肽，所述的ridd-riad短肽由ridd和riad组成。
12、优选的，编码所述riad的核苷酸序列包含seq id no：23，或与seq id no：23具有60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上或90%以上同源性。
13、优选的，编码所述ridd的核苷酸序列包含seq id no：24，或与seq id no：24具有60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上或90%以上同源性。
14、优选的，所述riad的氨基酸序列包含seq id no：28，或与seq id no：28具有60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上或90%以上同源性。
15、优选的，所述ridd的氨基酸序列包含seq id no：25，或与seq id no：25具有60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上或90%以上同源性。
16、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的idi-isps复合体包括下列组中任一种：
17、a）异戊烯基焦磷酸异构酶和其c端和/或n端连接的ridd，以及，异戊二烯合成酶和其c端和/或n端连接的riad；或，
18、b）异戊烯基焦磷酸异构酶和其c端和/或n端连接的riad，以及，异戊二烯合成酶和其c端和/或n端连接的ridd。
19、优选的，异戊烯基焦磷酸异构酶和其c端和/或n端连接的ridd之间，以及，异戊二烯合成酶和其c端和/或n端连接的riad之间；或，异戊烯基焦磷酸异构酶和其c端和/或n端连接的riad之间，以及，异戊二烯合成酶和其c端和/或n端连接的ridd之间，分别独立的可以为直接连接或间接连接。
20、进一步优选通过gs、（g4s）n、ggggsggggsggggcg（seq id no：29）或ggggsggggsggggcgs（seq id no：30）中任一种连接，其中，n为大于0的整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上。
21、优选的，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶来源于链球菌属（ streptococcus）。
22、进一步优选的，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶来源于肺炎链球菌（ streptococcus pneumoniae）。
23、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶的氨基酸序列包括seq id no：26或包含与seq id no：26所示氨基酸序列具有60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上或90%以上同源性的氨基酸序列。
24、优选的，所述的异戊二烯合成酶来源于杨属（ populus）。
25、进一步优选的，所述的异戊二烯合成酶来源于银白杨（ populus alba）。
26、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的异戊二烯合成酶的氨基酸序列包括seqid no：27所示氨基酸序列或包含与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌表达IDI-ISPS复合体，所述的IDI-ISPS复合体包括异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶，其中，异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶通过连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌包含下列一种或两种以上的改造：
3.根据权利要求2所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的甲基赤藓糖醇磷酸途径关键酶包括1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶或5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶中的一种或两种；
4.根据权利要求1或2所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶、甲基赤藓糖醇磷酸途径关键酶或甲羟戊酸途径关键酶的表达受启动子的调控；
5.根据权利要求1或2所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶、甲基赤藓糖醇磷酸途径关键酶或甲羟戊酸关键酶在表达载体上表达，或，整合至重组盐单胞菌的染色体上表达。
6.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的连接肽包含RIDD-RIAD短肽
7.根据权利要求6所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的IDI-ISPS复合体包括下列组中任一种：
8.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌的基因组中包含导入基因；
9.根据权利要求8所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述导入基因的拷贝数为单拷贝或两个以上拷贝。
10.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌包括Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis、Halomonas desiderata、Halomonas cupida、Halomonas smymensis、Halomonas levan、Halomonas lutescens、Halomonas elongata、Halomonas venusta或Halomonas alkaliantarctica。
11.一种权利要求1-10任一所述的重组盐单胞菌的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将异戊烯基焦磷酸异构酶编码基因和异戊二烯合成酶编码基因导入盐单胞菌中；
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括下列组中任一种或两种以上：
13.一种生产异戊二烯的方法，其特征在于，所述的方法包括培养权利要求1-10任一所述的重组盐单胞菌，或，权利要求11-12任一所述制备方法获得的重组盐单胞菌。
14.一种权利要求1-10任一所述的重组盐单胞菌，或，权利要求11-12任一所述制备方法获得的重组盐单胞菌在制备化合物或组合物中的应用，其特征在于，所述的化合物或组合物包括异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、定级橡胶、合成异戊烯氯、甲基庚烯酮、芳樟醇、柠檬醛、月桂烯、薰衣草醇、光刻胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂或催化剂中的一种或两种以上。
...【技术特征摘要】
1.一种重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌表达idi-isps复合体，所述的idi-isps复合体包括异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶，其中，异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶通过连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌包含下列一种或两种以上的改造：
3.根据权利要求2所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的甲基赤藓糖醇磷酸途径关键酶包括1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合成酶或5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶中的一种或两种；
4.根据权利要求1或2所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶、甲基赤藓糖醇磷酸途径关键酶或甲羟戊酸途径关键酶的表达受启动子的调控；
5.根据权利要求1或2所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的异戊烯基焦磷酸异构酶、异戊二烯合成酶、甲基赤藓糖醇磷酸途径关键酶或甲羟戊酸关键酶在表达载体上表达，或，整合至重组盐单胞菌的染色体上表达。
6.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的连接肽包含ridd-riad短肽，所述的ridd-riad短肽由ridd和riad组成。
7.根据权利要求6所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的idi-isps复合体包括下列组中任一种：
8.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌的基因组中包含导入基因；
9.根据权利要求8所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述导入基因的拷贝数为单拷贝或两个以上拷贝。
【专利技术属性】
技术研发人员：张瑶瑶，李莉，杜开心，黄悟哲，刘絮，
申请(专利权)人：北京微构工场生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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