【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种快速检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法。
技术介绍
1、聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，pha)是由多种微生物合成的一种天然高分子聚酯，在生物体内主要作为碳源和能量的储存物质而存在。pha不仅具有类似于合成塑料的物化特性，还具有良好的生物可降解性、生物相容性及压电性等诸多优秀性能，因而被认为是环境友好型材料，已被应用于包装材料、电学材料、生物医用材料等领域。
2、目前已合成的pha种类超过150种，其性质从热塑性耐用聚酯到粘性树脂，可满足不同的需求。其中，商业化pha有四种，分别为聚3-羟基丁酸酯(phb)、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(phbv)、聚-3-羟基丁酸-3羟基己酯(phbhhx)和聚-3-羟基丁酸-4羟基丁酸酯(p34hb)。
3、目前微生物发酵法是工业生产pha的主要方法。其胞内pha的含量是pha生产发酵工艺的重要指标。为了进一步完善pha的生产发酵工艺、特性研究与应用开发，需要建立准确的胞内pha检测方法。
4、pha检测方法有重量分析法及染色法、紫外光谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、核磁共振法、流式细胞光度和荧光分光光度法及傅立叶变换红外光谱技术。其中，气相色谱法是检测pha的标准方法。在酸性条件下，向pha样品中加入苯甲酸、甲醇和氯仿，然后在加热、冷却后添加适当的蒸馏水，等待溶液分层，最后取适当有机相进行气相色谱检测，可间接测定pha。在该方法中，pha可以被还原成相应聚合物的单体，加入苯甲酸作为酯化反应过
5、然而，现有气相检测分析法，需先将发酵液进行离心，获得菌体，洗涤菌体并冷冻干燥，将干燥后的菌体称重后，再和甲醇-氯仿在酸性条件下100℃反应4h左右，再经过萃取除去甲醇后，将有机相进入气相色谱仪进行分析。该方法的缺点是菌体样品前处理和酯化时间均较长，不适合大规模生产的实时监测需求。
技术实现思路
1、由于现有技术中对pha含量进行测定时，菌体样品的前处理和酯化较为费时费力，需要较长时间的样品前处理过程和较长时间的酯化处理，无法实时检测发酵液中的pha含量，提供发酵工艺过程指导。
2、本专利技术从发酵液中收集得到菌体后，通过直接烘干菌体和加快酯化反应速度，可以缩短检测时间，在短时间内精确获得菌体中pha单体的比例，以便在发酵过程中及时调整发酵工艺，获得目标单体比例的pha。
3、现有技术中，直接缩短酯化反应时间，会导致样品酯化不完全，pha含量和单体比例低于正常检测值，不能准确指导发酵工艺调整和实现目标产物pha的生产。
4、基于此，本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：从发酵液收集得到所述菌体，将所述菌体烘干后进行酯化。
5、本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法中，所述烘干包括：110～160℃处理15～20min。
6、优选地，所述烘干包括：120～130℃处理15～20min。
7、本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法中，所述酯化采用的酯化液中含有体积浓度为3～5％的浓硫酸，所述酯化时菌体的质量为30～75mg；酯化体系中，菌体质量浓度为7.5～18.75％；
8、优选地，所述酯化时菌体的质量为30～50mg；酯化体系中，菌体质量浓度为7.5～12.5％；
9、更优选地，所述酯化采用的酯化液中含有体积浓度为5％的浓硫酸，所述酯化时菌体的质量为30mg；酯化体系中，菌体的质量浓度为7.5％。
10、本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法中，所述酯化液由苯甲酸、浓硫酸和有机溶剂配制而成；所述酯化液中，苯甲酸的质量体积浓度为0.5g/l；优选地，所述有机溶剂为甲醇。
11、本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法中，所述酯化的反应条件为：100～110℃反应2～3.5h。
12、本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法中，所述酯化液中浓硫酸的体积百分数为3％时，所述酯化的反应条件为100℃反应3.5h；
13、或，所述酯化液中浓硫酸的体积百分数为3％时，所述酯化的反应条件为110℃反应3h；
14、或，所述酯化液中浓硫酸的体积百分数为5％，菌体的质量为30mg时，所述酯化的反应条件为110℃反应2～3h，此时酯化体系中，菌体的质量浓度为7.5％。
15、优选地，所述酯化液中浓硫酸的体积百分数为5％，菌体的质量为30mg时，所述酯化的反应条件为110℃反应2h，此时酯化体系中，菌体的质量浓度为7.5％。
16、本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法中，包括：
17、(1)发酵液离心弃上清收集菌体，将所述菌体在130℃处理15～20min后充分捣碎混合均匀，获得烘干后的菌体；
18、(2)向步骤(1)烘干后的菌体中加入酯化液进行酯化，所述酯化液由苯甲酸、浓硫酸和甲醇配制而成；
19、(3)步骤(2)所述酯化结束后，向冷却后的酯化反应体系中加入去离子水进行分层，下层有机相用于气相色谱分析。
20、本专利技术所提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，所述气相色谱分析的色谱柱为agilent hp-5柱。
21、具体地，本专利技术提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：
22、(1)发酵液离心弃上清收集菌体，将所述菌体洗涤后，烘干捣碎混合均匀，获得烘干后的菌体；
23、(2)向步骤(1)烘干后的菌体中加入酯化液进行酯化，(3)步骤(2)的酯化反应结束后，待酯化体系冷却至50℃以下时，加入1～2ml的去离子水，充分震荡混匀，静置待液体分层后，取下层有机相用于气相色谱分析；
24、(4)气相色谱分析中，进样口温度240℃；检测器温度250℃；起始温度为80℃，维持1.5min后进入第一阶段升温，再进入第二阶段升温，升温至240℃后维持2min，总程序时间8min；其中第一阶段升温速率为30℃/min，第二阶段升温速率为40℃/min；
25、(5)通过读取气相色谱测得的内标峰面积、标样的聚羟基脂肪酸酯单体甲酯峰面积、样品的内标峰面积和样品聚羟基脂肪酸酯单体甲酯峰面积进行相应聚羟基脂肪酸酯单体比例的计算。
26、作为本专利技术的一个具体实施方式，本专利技术所提供的检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法中，包括：
27、(1)取8～10ml发酵液，8000～10000rpm离心8～10min，弃上清收集菌体，将所述菌体洗涤后，在130℃处理15min后充分捣碎混合均匀，获得烘干后的菌体；
28、(2)称取步骤(1)烘干后的菌体30～75mg，向菌体中加入1～2ml的酯化液在100℃反应3.5h或在110℃反应2～3h，所述酯本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括：从发酵液收集得到所述菌体，将所述菌体烘干后进行酯化。
2.根据权利要求1所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述烘干包括：110～160℃处理15～20min；
3.根据权利要求1～2任一项所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述酯化采用的酯化液中含有体积浓度3～5％的浓硫酸，所述酯化时菌体的质量为30～75mg；
4.根据权利要求3所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述酯化液由苯甲酸、浓硫酸和有机溶剂配制而成；所述酯化液中，苯甲酸的质量体积浓度为0.5g/L；优选地，所述有机溶剂为甲醇。
5.根据权利要求1～4任一项所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述酯化的反应条件为：100～110℃反应2～3.5h。
6.根据权利要求5所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述酯化液中浓硫酸的体积百分数为3％时，所述酯化的反应条件为100℃反应3.5h；
7.根据权利要求1～6任一项所述检测菌体中聚羟
8.根据权利要求7所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述气相色谱分析的色谱柱为Agilent HP-5柱。
9.根据权利要求8所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括：
10.根据权利要求1～9任一项所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述聚羟基脂肪酸酯包括：聚3-羟基丁酸酯、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯、聚-3-羟基丁酸-3羟基己酯和聚-3-羟基丁酸-4羟基丁酸酯中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括：从发酵液收集得到所述菌体，将所述菌体烘干后进行酯化。
2.根据权利要求1所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述烘干包括：110～160℃处理15～20min；
3.根据权利要求1～2任一项所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述酯化采用的酯化液中含有体积浓度3～5％的浓硫酸，所述酯化时菌体的质量为30～75mg；
4.根据权利要求3所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述酯化液由苯甲酸、浓硫酸和有机溶剂配制而成；所述酯化液中，苯甲酸的质量体积浓度为0.5g/l；优选地，所述有机溶剂为甲醇。
5.根据权利要求1～4任一项所述检测菌体中聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，所述酯化的反应条件为：100～...
【专利技术属性】
技术研发人员：张瑶瑶，杜开心，郑陶然，刘絮，黄悟哲，
申请(专利权)人：北京微构工场生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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